学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪PNPLA3、4基因的克隆及功能研究

作　者: 高欣
导　师: 杨在清
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 梅山猪 PNPLA3 PNPLA4 基因克隆剪接体染色体定位组织表达谱 KLF15 基因表达调控
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 78次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

梅山猪是我国优秀地方猪种,是国内外猪遗传育种的重要品种资源,其重要功能基因的克隆、分析鉴定和生物学特性研究有助于积累和开发利用我国重要地方猪种的基因资源信息,为优良猪种的遗传改良提供理论依据。Patatin作为进化中保守的结构域在脂肪代谢中起重要作用。最近发现的人PNPLAs(patatin-like phospholipases)家族中PNPLA2、3、4在脂肪合成和分解代谢中有重要作用。但是目前未见有关猪PNPLA3、4基因的研究报道。为了深入了解猪PNPLA3、4在脂肪代谢中的生物学功能,本文以梅山猪为研究对象,克隆了PNPLA3、PNPLA4基因及其选择性剪接体,利用辐射杂种板技术和电子定位技术确定了其染色体定位,并采用实时定量PCR等方法分析了其组织表达谱。为了解猪PNPLA3的表达调控机制,本文利用瞬时转染转录因子KLF15的猪肾细胞系,通过实时定量PCR测定PPARγ,和PNPLA3 mRNA的表达差异,并利用油红O染色法检测猪肾细胞积累脂肪含量的变化。本文的主要研究结果如下:1.扩增得到梅山猪PNPLAs家族PNPLA3 cDNA序列和PNPLA4含全长编码区的cDNA序列,并对其进行了DNA和氨基酸序列分析。本实验扩增得到的猪PNPLA3 cDNA2555 bp,编码区全长为1326bp,编码441个氨基酸;在蛋白质水平上,本实验获得的猪PNPLA3氨基酸序列与人(NP 079501)、小鼠(NP 473429)、大鼠(XP 343302)的PNPLA3的同源性依次是61.5%、55.2%、57.2%。扩增得到猪PNPLA4 cDNA 819 bp,包括全长编码区771 bp,编码256个氨基酸;在蛋白水平上,与人的PNPLA4(NP 001135861)有61.5%的同源性。2.实验结果证实在猪中存在PNPLA4的一个差异剪接体,相对于野生型全长PNPLA4 variant1命名为PNPLA4 variant2,得到包含705bp全长编码区的753bp的cDNA序列,编码234个氨基酸,它是由野生型PNPLA4 variant1完全缺失第四个外显子66bp所产生。这种剪接方式可能只存在于猪中。通过RT-PCR定性检测发现PNPLA4 variant2除了在肺、脂肪和大脑中没有检测到外,在其他组织中都有表达,但是表达量低于PNPLA4 variant2。3.通过辐射杂种板技术将猪PNPLA3基因定位在5p11-15。通过电子定位技术将猪PNPLA4定位于Xp24。并且通过比对猪-人比较基因组图谱证实这两个基因的定位结果与人相应基因在染色体上的位置相对应。4.通过实时定量PCR的方法研究了猪PNPLA3、4基因在mRNA水平上的组织表达谱。结果表明猪PNPLA3、4表达的组织特异性较强,猪PNPLA3在脂肪和肝中高量表达,在心脏、肺和肾脏中低表达,在脾、肠、大脑中几乎检测不到表达。猪PNPLA4基因表达除在肝中表达量比较高心中有表达以外,在其他组织中表达量很低。5.以遗传脂肪型猪(通城猪)和遗传瘦肉型猪(大白猪)的组织样品为材料,对mRNA水平上PNPLA3在两种不同类型猪中的组织表达差异进行了研究。结果显示PNPLA3基因在通城猪肝脏中表达量显著低于大白猪的相应组织,在脂肪组织中差异不显著。6.使用已有KLF15的真核表达载体(PcDNA3.1-KLF15表达载体)和PcDNA3.1空载体转染IBRS-2细胞24hrs后,油红O染色法检测脂肪积累变化,实时定量PCR检测PPARγ和PNPLA3 mRNA水平的变化。结果表明KLF15促进IBRS-2细胞脂肪积累,显著上调PPARγ和PNPLA3 mRNA的表达,推测KLF15可以调控PNPLA3的表达。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略语表  12-14
1 前言  14-24
  1.1 脂肪细胞分化及其分子调节  14-18
    1.1.1 转录因子与脂肪细胞分化  15-16
    1.1.2 KLF15与脂肪细胞分化  16-17
    1.1.3 激素对脂肪细胞分化的诱导  17-18
    1.1.4 激素对脂肪细胞生成的抑制  18
  1.2 脂肪的积累与动员  18-19
    1.2.1 脂滴的形成  18
    1.2.2 脂肪代谢的调控  18-19
    1.2.3 脂肪代谢紊乱  19
  1.3 PNPLA3、4的结构与功能  19-23
    1.3.1 PNPLA3相关研究进展  20-22
    1.3.2 PNPLA4相关研究进展  22-23
  1.4 研究的目的和意义  23-24
2 材料与方法  24-40
  2.1 材料  24-28
    2.1.1 实验动物及RNA样品  24
    2.1.2 DNA样品  24-25
    2.1.3 工具酶及主要生化试剂  25
    2.1.4 试剂盒  25
    2.1.5 质粒和菌株  25-26
    2.1.6 细胞  26
    2.1.7 主要仪器  26
    2.1.8 常用试剂配制  26-27
    2.1.9 分子生物学软件  27-28
  2.2 实验方法  28-40
    2.2.1 总RNA的提取、纯化处理及鉴定  28-30
    2.2.2 基因及其剪接体的RT-PCR扩增  30-35
    2.2.3 IMpRH克隆板技术的染色体定位  35-36
    2.2.4 染色体的电子定位  36
    2.2.5 qPCR分析基因的组织表达谱  36-37
    2.2.6 基因及其剪接体的RT-PCR分析  37-38
    2.2.7 细胞培养及基因转染  38-40
3 结果与分析  40-55
  3.1 总RNA质量和含量测定  40-41
  3.2 猪PNPLA3、4基因cDNA的克隆与序列分析  41-49
    3.2.1 PNPLA3基因cDNA的克隆  41-42
    3.2.2 PNPLA4基因cDNA及其选择性剪接体的克隆  42
    3.2.3 PNPLA3、4序列分析  42-48
    3.2.4 猪PNPLA4基因差异剪接体序列分析  48
    3.2.5 猪PNPLA4及其差异剪接体表达检测  48-49
  3.3 猪PNPLA3、4染色体定位  49-51
    3.3.1 猪PNPLA3基因的染色体定位  49-50
    3.3.2 猪PNPLA4基因的染色体定位  50-51
  3.4 猪PNPLA3、4基因组织表达谱  51-52
  3.5 PNPLA3基因在脂肪和肝脏中表达的遗传差异  52-53
  3.6 KLF15对PNPLA3表达和脂肪积累的影响  53-55
4 讨论  55-59
  4.1 PNPLA3、4基因的结构  55-57
  4.2 PNPLA3、4基因的染色体位置  57-58
    4.2.1 辐射杂种板细胞系技术作为基因定位方法的优缺点  57
    4.2.2 猪PNPLA3基因染色体定位区的QTL分布  57-58
    4.2.3 PNPLA4基因电子定位技术  58
  4.3 猪PNPLA3、4基因表达的遗传差异  58-59
  4.4 KLF15对PNPLA3基因表达的调控  59
5 结论与创新点  59-61
  5.1 结论  59-60
  5.2 创新点  60-61
参考文献  61-66
研究生在读期间论文发表情况  66-67
致谢  67-68
附录  68-70

猪PNPLA3、4基因的克隆及功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文