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福州市荔枝古树遗传多样性的RAPD分析及离体保存研究

作　者: 李焕苓
导　师: 赖钟雄；林治良；徐炜
学　校: 福建农林大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 荔枝古树 RAPD 胚性愈伤组织限制生长保存 GPX 基因克隆蛋白质组学
分类号: S667.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

荔枝(Litchi chinensis)在我国栽培历史至少有2000多年,是我国南方特色的热带珍贵果树之一;同时,在我国南方,荔枝还是重要的热带南亚热带风光代表性的风景树,在城市园林绿化和风景区得到广泛应用。古树、名木在园林景观中往往是一道无与伦比的风景线,是历代陵园、名胜古迹的佳景之一,也是一个城市重要的自然和人文景观;古树的基因图谱往往有其特殊性,具有长寿基因和抗性基因以及其他有价值的基因,是植物遗传改良的最宝贵的种质材料。福州市荔枝古树资源丰富,在荔枝史上的占重要地位。鉴于此,我们首先采用RAPD分子标记对福州市荔枝古树资源进行遗传多样性分析,进一步对福州市荔枝古树的核心种质进行离体限制生长保存研究,并采用分子生物学和蛋白组学手段对荔枝古树离体保存机理进行研究。主要研究结果如下:1.福州市荔枝古树遗传多样性的RAPD分析本试验采用RAPD技术对福州市66份荔枝古树资源(含2份据传说是福州西湖“十八娘”古荔枝后代的资源)进行了遗传多样性分析。研究结果表明:16个随机引物共产生232条RAPD带,其中216条为多态性带,占总带数的93.10%,表明66份荔枝古树资源有丰富的多样性。根据扩增条带多态性,利用UPGMA构建了荔枝古树的亲缘关系树状图,遗传距离为0.000-1.000。当D=0.909时,66份荔枝古树资源可以分为3组;当D=0.746时,分为9组;当D=0.578时,可归为18组,福州市区荔枝古树可分为17组,另1组为2份据传说是福州西湖十八娘古荔枝后代的资源。同一地方的荔枝古树基本可以划分在一起,但也有个别划分在不同组,亲缘关系较远,说明福州市区荔枝古树群体存在一定的遗传变异。根据荔枝古树RAPD条带的代表性,结合考虑树龄和知名度等因素,初步确定17个荔枝古树为福州市荔枝古树的核心种质。2.福州市荔枝古树种质资源的离体限制生长保存及体胚发生通过花药培养诱导得到了17个荔枝古树核心种质的胚性愈伤组织(emberyogenic callus, EC),并确定最佳离体保存方案为:接种量每瓶50 mg,分为3团接种于附加2,4-D1.0 m g?L-1、甘露醇2%、蔗糖20 g?L-1、琼脂8 g?L-1的MS培养基上,在20℃,pH 5.8,暗培养,可以将荔枝古树EC的继代周期延长至125 d。保存后的荔枝古树EC有强烈的体胚发生能力及植株再生能力。遗传稳定性进行RAPD检测表明:限制生长保存后荔枝古树EC的变异率为7.70%。3.福州市荔枝古树EC的GPX活性研究及其基因的克隆以常规继代保存和最佳离体保存的荔枝古树EC为材料,进行了保存过程中GPX活性变化的研究。结果表明:最佳离体保存和常规继代保存下,荔枝古树愈伤组织保存过程中的GPX活性呈规律表达,均出现两个高峰值,说明荔枝古树EC的GPX与维持荔枝古树胚性愈伤组织的离体保存密切相关。第一个GPX酶活性最高值的出现与胚性愈伤组织大量增殖有关,是生长高峰即将到来的标志。第2个GPX酶活性最高值的出现是愈伤组织进入衰老期的象征。但在最佳保存方案下,荔枝古树胚性愈伤组织的两个GPX高峰期的出现要分别比对照(常规继代保存)下迟得多。从西禅寺“宋荔”花药EC克隆获得抗性基因GPX的cDNA和DNA全长。其cDNA开放阅读框大小是507 bp(登录号:FJ172343);其DNA全长大小是1809 bp(登录号:FJ465145),由5个外显子和4个内含子组成。同时,应用生物信息学方法分析了GPX基因编码的蛋白质的理化性质、亲疏水特性、二级和三级结构、跨膜结构、结构功能域、信号肽、磷酸化位点预测、模序(Motif)分析、亚细胞定位、分子进化等进行预测分析。4.福州市荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中蛋白组学研究采用固相pH梯度凝胶双向电泳技术和生物质谱(肽质量指纹谱PMF和串联质谱)技术对常规继代保存过程(15 d、20 d、30 d)中的荔枝古树胚性愈伤组织进行蛋白组学研究,并以常规继代保存30 d的EC和最佳离体保存方案下30 d的EC进行差异蛋白组学研究。(1)荔枝古树EC离体保存过程中蛋白组分、MW和pI变化荔枝古树EC在常规保存过程(15 d、20 d、30 d)和最佳保存方案保存(30 d)中的蛋白组分、MW和pI变化为:①随着培养天数的增加,蛋白点数目变化是先下降后上升趋势,分别为1311、1256、1441个;在最佳保存方案的蛋白点数目少于常规保存的蛋白点数目,仅为1023个,表明在快速生长和接近衰老时期蛋白质合成活跃,而在最佳保存方案则蛋白合成相对较少,处于“休眠”状态。②随着培养天数的增加,小分子量(<15KD)蛋白所占比例呈逐渐减少趋势;在最佳保存方案小分子量蛋白占总蛋白比例明显增加,推测可能小分子量蛋白多是维持胚性愈伤组织正常生长的蛋白。③随着培养天数的增加,pI在4-5之间的蛋白质比例逐渐增加,pI在5-6之间的蛋白质变化幅度较小,pI在6-7之间的蛋白质比例逐渐降低;在最佳保存方案下pI在5-7之间的蛋白点比例增大,特别是pI5-6增加最为明显,pI在4-5之间的蛋白点比例较小,推测维持胚性愈伤组织正常分裂增殖的蛋白pI多集中在5-7之间,衰老或抗衰老氧化蛋白的pI多集中在4-5之间。(2)荔枝古树EC离体保存过程中相关蛋白的质谱鉴定及其功能分析采用串联质谱技术或肽指纹-串联质谱技术方法对双向电泳分离得到离体保存相关蛋白质进行了质谱鉴定,成功鉴定39个蛋白(p<0.05)。鉴定的蛋白可以分为八个功能类群,即氨基酸代谢(1个蛋白)、脂类代谢(2个蛋白)、核酸代谢(2个蛋白)、蛋白代谢与修复(15个蛋白)、细胞组成与信号转导(2个蛋白)、能量和碳代谢(4个蛋白)、胁迫反应与氧化还原(8个蛋白)及功能未知蛋白(5个蛋白)等。成功鉴定蛋白的功能分析表明:荔枝古树EC在常规保存过程中能量和碳代谢相关蛋白的表达呈先降低再升高趋势;信号传导相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白的表达呈逐渐下降表达趋势;胁迫反应/氧化还原相关蛋白、细胞组成相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、蛋白质代谢与修复相关蛋白的表达呈稳定表达状态。荔枝古树EC继代30 d时,胁迫反应/氧化还原相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、蛋白合成相关蛋白在常规保存EC有较强表达,在最佳保存EC则表达较小或不表达;蛋白降解相关蛋白、能量和碳代谢相关蛋白、细胞组成相关蛋白、蛋白修复相关蛋白在最佳保存EC和常规继代EC中表达差异不大;信号传导相关蛋白在最佳保存EC表达量高于常规保存EC。

福州市荔枝古树遗传多样性的RAPD分析及离体保存研究

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