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SELDI技术建立中药类肿瘤MDR逆转剂的快速筛选方法及4种中药逆转作用的体外研究

作　者: 唐海桦
导　师: 梁钢
学　校: 广西医科大学
专　业: 药理学
关键词: 蛋白质芯片 高通量技术 口腔鳞癌 表面加强激光解析电离-飞行时间质谱 多药耐药 SELDI-TOF-MS 中药 EGCG 大黄素 两面针碱 板蓝根 岩黄连 逆转 Western blot 免疫细胞化学
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:优化SELDI飞行时间质谱蛋白质芯片技术的实验条件,建立比较稳定的技术平台。方法:采用CM-10、H4、IMAC-3-Cu三种蛋白质芯片,经表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)的高通量技术对人口腔鳞癌(OSC)细胞株KB的蛋白质谱进行测定,筛选肿瘤细胞裂解液的最佳蛋白质芯片,摸索芯片最佳技术参数,评估该技术的稳定性和可靠性。结果:三种芯片均可检测到数百个蛋白质,蛋白质芯片显示蛋白质峰质荷比(M/Z)主要在1000-30000范围内;蛋白质谱显示峰最多的是CM-10,其次为H4,IMAC-3-Cu较少。同一芯片蛋白质峰强度的变异系数(CV)值为0.058038,M/Z的CV值为0.000121;不同芯片间蛋白质峰强度的CV值为0.071305,M/Z的CV值为0.000152。结论:SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术重复性高、稳定性好,是比较理想的蛋白质组学研究技术平台;CM-10是细胞蛋白质组学研究的重要工具,本课题今后采用的蛋白质芯片均为CM-10芯片;样品的质量控制和操作过程的标准化将直接影响实验结果的可靠性。目的:应用表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术结合CM-10芯片筛选人口腔鳞癌亲本耐药细胞株间差异性表达蛋白质。方法:甲基四唑蓝(MTT)法检测人口腔鳞癌敏感株KB和多药耐药株KBV200对6种化疗药物的IC50,确定相应耐药指数;分别提取KB及KBV200的细胞总蛋白,应用SELDI-TOF-MS技术检测两组样品细胞裂解液的蛋白质指纹图谱;采用Ciphergen Protein Software 3.2.0软件对两者采集的蛋白质峰进行比较,峰强度相差0.5倍以上者定义为差异蛋白质。结果:VCR诱导的人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200对VCR具明显抗药性,耐药倍数为56.7,虽然对环磷酰胺、ara-C抗药性不明显,但是对ADM、DDP、5FU有交叉抗药性。在质荷比(M/Z) 2 000-50 000范围内,CM-10芯片在KB与KBV200间共捕获到18个差异蛋白质(P < 0.05),M/Z分别为2289,2546,3824,3997,4113,4941,4968,5149,5654,5971,6084,7272,7879,9961,10093,10289,10838,22703,其中上调表达14个,下调表达4个。结论:应用SELDI-TOF-MS方法能有效地从耐药细胞株KBV200中筛选出特异性的表达蛋白,从小分子蛋白质表达方面补充了人口腔鳞癌多通道多途径的耐药机制研究。目的:应用SELDI-TOF-MS方法筛选5种中药成分作用人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200前后的差异性表达蛋白质。方法:MTT法检测KBV200对5种中药成分的IC10,确定非毒性剂量浓度。采用SELDI-TOF-MS技术结合CM-10芯片对药物作用前后的KBV200细胞总蛋白提取液进行蛋白质指纹图谱检测,采用Ciphergen Protein Software 3.2.0软件和Biomarker Wizard软件对两者采集的蛋白质峰进行比较,峰强度相差0.5倍以上者定义为差异蛋白质。结果:质荷比(M/Z) 2 000-50 000范围内,CM-10芯片在EGCG作用KBV200前后间共捕获13个差异蛋白质峰(P < 0.05),其中3997 Da,4941 Da,4968 Da,5971 Da,6084 Da这5个蛋白质峰在KB中表达含量较低,在KBV200中表达含量明显升高(P < 0.05),EGCG作用后其各自的表达含量明显降低(P < 0.05);大黄素作用KBV200前后间共捕获6个差异蛋白质峰(P < 0.05),其中5971 Da的蛋白质峰在KB中表达含量较低,在KBV200中表达含量明显升高(P < 0.05),大黄素作用后其表达含量明显降低(P < 0.05);两面针碱作用KBV200前后间共捕获7个差异蛋白质峰(P < 0.05),但并未发现在KB、药物作用前后的KBV200这三种细胞中同时发生变化的蛋白峰;板蓝根粗提物和岩黄连粗提物作用KBV200前后间并未捕获到差异蛋白质峰。结论:分子量2 000-50 000 Da范围内,与KB比对,发现EGCG和大黄素作用KBV200前后均捕获有差异蛋白质峰,这些差异性表达蛋白质可能与逆转KBV200耐药有关。75目的:初步分析4种中药成分逆转KBV200细胞株的体外机制。方法:采用MTT法分别对4种中药成分进行体外细胞毒性试验和药物逆转耐药性浓度依赖性试验,分别测定其逆转倍数; Western blot法、免疫细胞化学(ICC)法分别检测了4种中药成分作用前后KBV200中耐药相关蛋白P-gp、LRP的量,GST-π、TOPO-Ⅱ的活性,以及肿瘤细胞调亡蛋白P53、Bcl-2/Bax比值的变化。结果: 0.7、1、1.4μg·mL-1的大黄素对KBV200毒增敏倍数分别为1.44、2.87、1.76倍;0.3、0.6、1.2μg·mL-1的两面针碱对KBV200毒增敏倍数分别为2.44、5.54、1.14倍;0.05、0.1、0.2μg·mL-1的板蓝根粗提物对KBV200毒增敏倍数分别为2.56、3.30、5.25倍;0.4、0.75、1.5μg·mL-1的岩黄连粗提物对KBV200毒增敏倍数分别为2.05、2.67、4.31倍;阳性对照剂VRP(5μg·mL-1)则为1.83倍。四种中药成分均能起细胞毒增敏作用,上调P53的表达,下调P-gp的表达(P < 0.05)(除两面针碱外);大黄素、板蓝根粗提物能下调LRP的表达量(P < 0.05);板蓝根粗提物还能降低GST-π的活性(P < 0.05);大黄素下调Bcl-2/Bax的比值,促进细胞凋亡,其余三种药物对Bcl-2/Bax的比值无太的影响;亲本耐药细胞间TOPO-Ⅱ的活性几乎无变化,但4种药物作用耐药细胞后TOPO-Ⅱ活性均不同程度上升。结论:四种中药成分体外均具有逆转人口腔鳞癌细胞KBV200多药耐药性的作用。大黄素逆转机制可能与下调P-gp、LRP表达,从而提高肿瘤细胞内药物的累积量;下调Bcl-2/Bax的比值,上调P53表达,促进肿瘤细胞的凋亡有关。两面针碱上调P53表达,可能与促进肿瘤细胞的凋亡有关。板蓝根粗提物逆转机制可能与下调P-gp、LRP表达,从而提高肿瘤细胞内药物的累积量;上调P53表达,促进肿瘤细胞的凋亡有关;同时还与降低GST-π的活性有关。岩黄连粗提物逆转机制可能与下调P-gp表达,从而提高肿瘤细胞内药物的累积量;上调P53表达,促进肿瘤细胞的凋亡有关。

全文目录


主要英文缩略语表及中英文对照  5-7
前言  7-11
第一部分 应用 SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术建立中药类肿瘤逆转剂快速筛选方法的初探  11-79
  第一节 SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术实验条件的优化  13-39
    中文摘要  13-14
    ABSTRACT  14-15
    引言  15-16
    材料与方法  16-27
    结果  27-35
    讨论  35-37
    参考文献  37-39
  第二节 SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术检测人口腔鳞癌亲本耐药细胞株间蛋白质的差异表达  39-56
    中文摘要  39-40
    ABSTRACT  40-41
    引言  41-42
    材料与方法  42-46
    结果  46-50
    讨论  50-53
    参考文献  53-56
  第三节 5 种中药成分作用人口腔鳞癌耐药细胞株前后差异性表达蛋白的筛选  56-79
    中文摘要  56-57
    ABSTRACT  57-59
    引言  59-60
    材料与方法  60-62
    结果  62-72
    讨论  72-75
    参考文献  75-79
第二部分 4 种中药成分逆转 KBV200 细胞株体外机制的初步分析  79-116
  中文摘要  79-80
  ABSTRACT  80-82
  引言  82-83
  材料与方法  83-89
  结果  89-104
  讨论  104-111
  参考文献  111-116
全文总结  116-117
创新点及待解决的问题  117-118
综述  118-132
致谢  132-133
攻读硕士学位期间发表的文章目录  133

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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