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生长素对harpin蛋白激发HR的调控机制初步研究

作　者: 龚晓崇
导　师: 宋从凤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 高效液相色谱法 harpinXoo IAA 逆转HR TIBA
分类号: S432.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

harpin蛋白能够激发植物过敏反应(hypersensitive response, HR),但是目前对植物如何调控植物过敏反应或细胞死亡的机制尚不清楚,哪些因素可以影响harpin蛋白激发植物的过敏反应是一个困扰已久的问题。众所周知,吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid, IAA),是最早发现的一类天然植物激素,属于生长素的一种,它参与并调控植物的许多生理活动,有证据表明生长素也参与植物的防卫反应。那么生长素是否会对harpin激发的植物过敏反应起作用?如果有,其调控机制如何?就此问题,我们以IAA为研究对象,建立了利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定烟草和棉花叶片中生长素含量的方法。这项研究能够快速分离和定量测定烟草和棉花叶片中生长素的含量,测定结果可靠,方法具有可行性。进一步对比6-8叶期的表达harpinxoo转基因烟草和棉花与非转基因对照植物体中的经不同实验处理后IAA的含量的差异变化,结果发现在接TMV后0-6 h内,转基因烟草IAA含量随时间表现出上升趋势,而对照转空载体烟草中IAA的变化呈降低趋势。接棉花黄萎菌后0-6 h内,转基因棉花IAA含量随时间表现出上升趋势,非转基因棉花IAA含量表现出下降趋势。为什么经病原物侵染后表达harpinxoo转基因植物(烟草和棉花)IAA的含量会升高,而作为对照的非转基因植物则表现下降趋势?我们猜想：植物体内生长素含量的高低可能会影响到harpin蛋白的作用。那么,对普通烟草体外施加一定浓度的生长素会不会抑制harpin蛋白引起的过敏反应呢?带着这些问题,我们分别从烟草表型和分子生物学角度对激素对蛋白激发的HR的影响进行了进一步的研究。选用普通烟草、纯化GST融合蛋白harpinxoo、10-4 mol/L IAA、500μM三碘苯甲酸(2,3,5-trllodobenzolc acid, TIBA,为IAA抑制剂)为主要试材,通过烟草表型观察,结果发现在表型上104mol/L IAA对harpinxoo在烟草叶片上激发的HR具有一定的抑制作用。分子检测方面,选取真核生物中高度保守并且为组成性表达的基因EF-1α作为内参基因,通过半定量PCR,检测了植物过敏反应标志基因hsr203J、抗病防卫基因chia5、硝酸还原酶基因nr,以及ChtA、ChtB、GluA、GluB等20多个基因的表达情况。并重点针对hsr203J和chia5做了荧光定量PCR的检测。结果显示：当烟草叶片未经任何实验处理时hsr203J和chia5无表达,nr有表达；10-4mol/L IAA和500μM TIBA单独作用于烟草叶片后对上述基因的表达均无影响；harpin蛋白激发烟草叶片产生HR, hsr203J和chia5有表达,nr无表达。10-4mol/LIAA与harpin蛋白复合处理使HR作用减弱,但此时基因hsr203J的表达却略有增加,基因chia5的表达明显降低,nr仍无表达。而经500μM TIBA处理抑制10-4mol/L IAA作用后,被IAA抑制的harpin蛋白激发的HR又能够得以部分恢复,所产生的HR斑大小介于蛋白HR斑和经10-4mol/L IAA和harpin蛋白复合处理的HR斑大小之间,此时hsr203J、chia5也有表达。只是基因hsr203J的表达较单独harpin蛋白作用产生HR和10-4mol/L IAA与蛋白复合处理都明显降低；基因chia5的表达却是比harpin蛋白激发烟草叶片产生HR的处理低,比经IAA和蛋白互作后表达要高,nr仍无表达。综合烟草表型实验和分子生物学检测,最后得出结论：生长素在一定程度上可以逆转harpin蛋白在烟草叶片上激发的植物过敏反应。这为进一步更深入研究harpin激发的HR的调控机制奠定了一定的理论基础。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11上篇文献综述 11-30 第一章 harpin蛋白激发的防卫反应及其应用功能研究进展 12-22 1 hrp基因和Harpin蛋白 12-14 2 Harpins在植物上的功能 14-16 2.1 诱导植物抗病 14-15 2.2 诱导植物抗虫 15 2.3 诱导植株耐旱 15-16 2.4 增产作用 16 3 harpin诱导的信号途径 16-17 4 harpin激发防卫反应 17-19 5 harpins的作用位点 19-22 第二章植物细胞过敏性坏死反应 22-26 1 HR与PCD、细胞凋亡间的异同 22 2 harpin蛋白激发HR的研究进展 22-24 3 Harpin蛋白中调控HR的功能域 24-26 第三章 IAA及其在植物防卫中的研究进展 26-28 第四章 HPLC技术在植物激素领域的应用状况 28-30下篇研究内容 30-65 第一章高效液相色谱法测定烟草和棉花中生长素含量 31-41 1 材料与方法 33-34 1.1 实验材料 33 1.2 仪器和试剂 33 1.3 样品前处理方法 33-34 1.3.1 烟草样品前处理方法 33-34 1.3.2 棉花样品前处理方法 34 1.4 IAA标准液及标准曲线的制备 34 1.5 色谱条件 34 2 结果与分析 34-38 2.1 流动相 34-35 2.2 流速和波长 35 2.3 柱温 35 2.4 最低检测限和定量限 35 2.5 样品添加回收率 35 2.6 样品测定结果 35-38 2.6.1 回归方程和相关系数 35-36 2.6.2 普通烟草和棉花叶组织中IAA含量 36-37 2.6.3 表达harpinXoo转基因烟草和棉花与转空载体烟草和非转基因棉花叶组织中IAA含量的差异 37-38 3 讨论 38-41 第二章生长素逆转harpin蛋白激发的HR及其相关基因表达 41-65 1 材料与方法 42-54 1.1 实验材料 42-45 1.1.1 植物材料和菌株 42 1.1.2 培养基 42 1.1.3 主要试剂 42-43 1.1.4 缓冲液 43-44 1.1.5 主要仪器 44-45 1.2 蛋白提取 45-47 1.3 蛋白活性测定 47-48 1.4 RNA的提取、反转录以及PCR检测 48-54 2 结果与分析 54-61 2.1 IAA对harpin诱导的HR的抑制作用 54 2.2 IAA抑制剂对IAA抑制HR作用的逆转作用 54-56 2.3 半定量PCR检测harpin处理烟草后组织中相关基因表达 56-57 2.4 半定量PCR检测IAA与harpin复合处理后烟草叶组织中相关基因表达 57-58 2.5 半定量PCR检测TIBA抑制IAA作用后烟草叶组织中相关基因表达 58-59 2.6 实时定量PCR定量检测基因hsr203J和chia5的表达 59-61 3 讨论 61-65全文总结 65-67参考文献 67-74英文名称及缩写词 74-75攻读硕士期间发表论文及待发表论文 75-77致谢 77-79本论文受资基金 79

生长素对harpin蛋白激发HR的调控机制初步研究

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