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靶向Bcl-2/Bcl-xL化合物Z40的促Hela细胞凋亡和自噬作用及分子机理研究
作 者: 李艳君
导 师: 刘惠荣;夏斌
学 校: 内蒙古农业大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结构设计 Z40 Bcl-xL Bcl-2 抑制剂 凋亡 自噬
分类号: R96
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bcl-xL在抑制细胞凋亡的过程中发挥重要的作用,因此针对它们的抑制剂有潜在的抗癌功能。本次研究中,我们在结构研究的基础上利用表面等离子共振和核磁共振分析的方法筛选到一个新的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂Z40,它可以非常有效地引起Hela细胞死亡。进一步的研究表明,在Hela细胞中,Z40可引起染色体浓缩,DNA凝集和片段化。Hoechst33342/PI共染试验显示,部分Z40处理后的Hela细胞呈高蓝色/低红色。这些结果说明Z40处理导致Hela细胞凋亡。Z40还可以诱导细胞色素c的释放和Caspase-3的激活,并且zDEVD-fmk可以抑制Z40引起的细胞死亡,说明由Z40诱导的细胞死亡具有Caspase-3依赖性。此外,Z40处理还导致GFP-LC3的点状聚集,GFP-LC3-II和LC3-II的含量增加以及具有双层膜结构的自噬泡的产生。3-MA可以抑制Z40引起的细胞死亡。说明在Hela细胞中,Z40也可引起自噬性死亡。总之,通过此次研究我们发现,针对Bcl-2/Bcl-xL的抑制剂可以同时引起凋亡和自噬性死亡。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-12 1 引言 12-19 1.1 细胞信号传导、蛋白质相互作用与癌症治疗 12 1.2 细胞死亡方式 12-16 1.2.1 非程序性细胞死亡 12-13 1.2.2 程序性细胞死亡 13-16 1.2.2.1 凋亡 13-14 1.2.2.1.1 凋亡的特征 13 1.2.2.1.2 凋亡的信号通路 13-14 1.2.2.2 自噬性程序性细胞死亡 14-16 1.2.2.2.1 自噬的特征及分类 14-15 1.2.2.2.2 参与自噬体形成的蛋白分子 15-16 1.3 Bcl-2 家族蛋白参与凋亡和自噬的调控 16-18 1.3.1 Bcl-2 家族蛋白成员 16 1.3.2 Bcl-2 家族蛋白参与凋亡的调控 16 1.3.3 Bcl-2 家族蛋白参与自噬的调控 16-17 1.3.4 Bcl-2/Bcl-xL 调节凋亡及自噬的结构基础 17-18 1.4 化合物Z40的结构以及与Bcl-xL的对接 18 1.5 作用于Bcl-2/Bcl-xL小分子化合物的国内外研究进展以及本课题研究意义 18-19 1.6 本课题研究思路 19 2 材料和方法 19-28 2.1 材料 19-22 2.1.1 化学药品 19 2.1.2 试剂及试剂盒 19-21 2.1.3 抗体 21 2.1.4 培养基 21 2.1.5 质粒载体 21 2.1.6 引物及核酸片段 21-22 2.1.7 仪器 22 2.2 试验方法 22-28 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 22 2.2.2 质粒构建 22-23 2.2.3 菌落 PCR 检测 23 2.2.4 质粒提取纯化 23-24 2.2.5 ~(15)N 标记 Bcl-xL 的原核表达纯化 24 2.2.6 未标记 Bcl-xL 的原核表达纯化 24 2.2.7 蛋白质 SDS-PAGE 检验 24-25 2.2.8 核磁滴定试验 25 2.2.9 表面等离子共振试验(Surface Plasmon Resonance,SPR) 25 2.2.10 质粒转染试验 25-26 2.2.11 细胞生长曲线绘制 26 2.2.12 细胞致死曲线绘制 26 2.2.13 Hoechst33342/PI染色结合流式细胞仪分析试验 26 2.2.14 细胞DNA 含量的流式细胞仪分析试验 26-27 2.2.15 凋亡细胞的细胞核形态观察 27 2.2.16 Western-blot 检测 27 2.2.17 透射电镜观察 27 2.2.18 细胞色素c释放试验 27 2.2.19 Caspase抑制试验 27 2.2.20 RNA干扰试验 27-28 2.2.21 自噬抑制试验 28 2.2.22 Bcl-xL过表达试验 28 3 结果分析 28-49 3.1 Bcl-xL 蛋白的原核表达纯化 28-31 3.2 Z40与Bcl-2及Bcl-xL结合的表面等离子共振(SPR)检测 31-35 3.3 化合物Z40与Bcl-xL蛋白结合位点的核磁滴定检测 35-36 3.4 Z40对Hela细胞生长及活力的影响 36-38 3.5 Bcl-xL过表达对Z40作用的影响 38-39 3.6 Z40 引起Hela 细胞凋亡的检测 39-44 3.6.1 Z40引起Hela细胞核皱缩和染色质浓缩 39-41 3.6.2 Z40 处理导致Hela 细胞DNA 断裂 41 3.6.3 Z40处理后细胞的Hoechst/PI染色试验 41-42 3.6.4 Z40处理导致细胞色素c释放 42-43 3.6.5 Z40处理导致Caspase-3被激活 43 3.6.6 Z40诱导的细胞死亡具有Caspase依赖性 43-44 3.7 Z40引起Hela细胞自噬性程序性死亡的检测 44-49 3.7.1 Z40处理导致Hela细胞中出现大量的自噬泡 44-45 3.7.2 Z40处理导致Hela细胞中GFP-LC3点状聚集 45-46 3.7.3 Z40 引起的自噬体可以与溶酶体融合 46-47 3.7.4 Z40处理导致Hela细胞中GFP-LC3-II及LC3-II的比例增加 47 3.7.5 Z40引起的自噬介导细胞死亡 47-49 4 讨论 49-51 5 结论 51-52 致谢 52-53 参考文献 53-56 作者简介 56
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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