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研究背景和目的：肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是指在慢性肝病和／或门脉高压基础上出现的肺内血管异常扩张,气体交换障碍,动脉血氧合作用异常导致的低氧血症及一系列病理生理变化与临床表现,通常包括肝硬化、动脉低氧血症和肺内血管扩张三联症。肺内毛细血管弥漫性扩张是肝肺综合征的基本病理改变,它的发生与扩血管物质一氧化氮(nitric oxide, NO)过度增加密切相关。局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK), FAK含有6个可被磷酸化的酪氨酸位点,即Tyr397、407、576、577、861和925,其中Tyr397是主要的自我磷酸化位点。外部因素(如整合素、生长因子、肿瘤坏死因子等)刺激诱导FAK在Tyr397位点自身磷酸化,由此为Src的SH2结构域创建一个高亲和力的结合位点,形成FAK/Src信号复合物并激活,FAK激活后可通过一系列信号通路如FAK-Ras-MAPK、FAK-PI3K等信号通路引起各种生物学效应。10号染色体同源丢失性磷酸酶与张力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)基因是一具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,它不仅有脂质磷酸酶活性,而且有蛋白磷酸酶活性。PTEN基因位于染色体10q23,其表达产物PTEN蛋白具有抑制细胞周期进展、诱导细胞凋亡以及抑制细胞迁移、铺展和局部黏附等生理功能。PTEN激活后通过其磷酸酶活性使P13K的脂类产物PIP3的D3位脱磷酸,进而使PI3K功能丧失,从而阻断PI3K/AKT信号通路。而PTEN表达的缺失或低表达则促进PI3K的过表达,进而引起PI3K活性的释放并激活Akt进而引起各种生物学效应。大量的实验证实肠细菌移位、肠内毒素血症、肺单核细胞或巨噬细胞系统的激活在HPS的发病原理中也许发挥重要作用。肝脏内毒素清除的机能失调,并且由于存在门体静脉分流,最终导致肠源性内毒素血症。内毒素诱导和激活体内单核／巨噬细胞系统,包括肝脏Kupffer细胞,脾脏巨噬细胞,肺血管巨噬细胞(PIMs)和血单核细胞。由于肝脏解毒减少,肺代偿性清除细菌和毒素。随后,血液单核细胞在肺血管内皮积累,然后分化为肺血管巨噬细胞(PIMs).PIMs吞噬作用的功能是增加血中细菌和毒素的清除。清除血液的体内异物之后,肺血管巨噬细胞(PIMs)被激活并分泌各种活化物质如NO, TNF-a, CO, IL-1, IL-6, IL-8和其他炎性介质。其中,TNF-α是具有代表性的炎性介质,它能诱导局部释放单核细胞趋化因子,并可以刺激内皮细胞和巨噬细胞表达粘附因子,进一步加剧了肺血管内巨噬细胞大量聚集与粘附。TNF-a能激活FAK及使PTEN表达减少,激活的FAK和表达减少的PTEN通过PI3K/Akt信号通路进一步作用于NF-κB,而NF-κB参与了包括iNOS和‘TNF-α在内的众多炎症因子的转录。这样导致了：一方面,巨噬细胞内iNOS过度表达,导致了NO过度生成；而另一方面,新生成的TNF-a又能进一步加强NF-κB的作用,从而形成级联正反馈,最终使NO过度生成,导致HPS的发生。HPS在肝硬化患者中的发生率约为15%-30%,其增加肝硬化患者的死亡率,预后极差。目前由于HPS的发病机理仍然不明,因此药物治疗的效果并不满意。肝移植是目前唯一能够有效的治疗与逆转HPS的方法。所以,研究肝肺综合征的发病机理,寻求有效的治疗方法至关重要。我们前期应用胆总管结扎(common bile duct ligation, CBDL)致大鼠肝肺综合征模型的实验结果说明手术模型组大鼠血浆TNF-a水平、动脉血气P(A-a)O2、NO水平较假手术组均明显升高,而应用TNF-a McAb治疗的大鼠的TNF-a等水平较同周的手术模型组均明显降低(有统计学意义),并发现应用TNF-a McAb治疗的大鼠的肝脏在组织学和生化指标上都有明显改善。我们的前期实验还证实了TNF-a是通过PI3K/Akt信号通路来实现其对下游因子的作用参与了HPS形成。FAK与PTEN是PI3K信号通路上游的因子,TNF-a可以激活FAK和可以使PTEN表达减少,因此,我们考虑TNF-a激活FAK、使PTEN表达减少,活化的FAK与表达减少的PTEN随之引起PI3K信号通路的改变可能参与了HPS形成。为此,我们采用TNF-a McAb治疗CBDL所致的HPS大鼠,观察TNF-a McAb干预治疗后对FAK、p-FAK. PTEN表达的影响。方法：应用CBDL致大鼠肝肺综合征的模型。把60只雄性Sprague Dawley大鼠随机地分为假手术组(sham组)、CBDL组(分为CBDL1周、2周、3周、4周、5周组五个亚组)及CBDL+TNF-αMcAb干预组(CBDL+TNF-αMcAb,分为胆总管结扎1周后TNF-αMcAb干预治疗1周、2周、3周、4周组四个亚组),共10个亚组,每组各6只大鼠。干预治疗组于术后1周开始给与腹腔注射肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(TNF-αMcAb(0.1g/kg/2d),而CBDL组大鼠对应的注射相当剂量的生理盐水,各组动物均在规定时间点取材(sham组与CBDL组第五周大鼠同时取材),应用免疫组织化学法(SP法)检测FAK和p-FAK在肺组织中的表达定位与表达程度；采用Western blot方法检测FAK、p-FAK和PTEN在肺组织中的蛋白表达。结果：1免疫组织化学法检测肺组织FAK和p-FAK的表达1.1肺组织FAK表达①CBDL组：大鼠肺组织内FAK蛋白的阳性表达较多,可见细胞胞浆呈棕褐色细颗粒,阳性表达多集中在肺内巨噬细胞胞浆中,于三周时达高峰(0.095±0.011),此后,CBDL组在四周时下降,五周时又见回升,表达均高于sham组(0.040±±0.005),差异有统计学意义(P<0.05).②TNF-αMcAb组：干预治疗一周(0.058±0.003)后,与CBDL相比,FAK蛋白表达即被明显抑制(P<0.05),此后,在各时间点FAK的阳性表达均比同时间点的CBDL组弱,基本维持在上述的水平,但是仍明显高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2肺组织p-FAK表达p-FAK蛋白的阳性反应为黄色颗粒,主要定位在肺巨噬细胞的胞浆。①CBDL组p-FAK蛋白阳性表达在术后三周达峰值(0.087±0.004),四周时下降,五周时又有所回升,与sham组(0.034±0.002)相比,阳性细胞数目和表达强度均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。②TNF-αMcAb干预治疗组：各时间点的p-FAK蛋白的阳性表达较CBDL组均有明显的减少,至治疗的第四周(0.035±±0.005)明显低于同周CBDL组(0.084±0.009),差异有统计学意义(P<0.05),干预治疗组4周时p-FAK蛋白的阳性表达虽高于sham组,但差异没有统计学意义(P>0.05)。2 Western Blot方法检测肺组织FAK、p-FAK和PTEN的表达2.1 Western Blot分析FAK①CBDL组FAK蛋白表达呈逐渐上升的趋势,于术后第三周达一个高峰值(1.01±0.10),此后呈下降趋势,均高于sham(0.27±0.02),差异有统计学意义(P<0.05)。②TNF-αMcAb组治疗1周(0.44±0.04)后与同时间的CBDL组相比较,即被明显的抑制,后三周干预治疗组亦低于CBDL组,差异有统计学意义(P<0.05),干预治疗组均高于sham组,差异亦有统计学意义(P<0.05)。2.2 Western Blot分析p-FAK:(DCBDL组p-FAK蛋白表达于术后第三周达一个高峰值(0.55±0.05),此后呈下降趋势,均高于sham组(0.10±0.01),差异有统计学意义(P<0.05);②TNF-αMcAb组治疗1周(0.18±±0.01)后与同时间的CBDL组相比较,即被抑制。后三周干预治疗组均明显低于CBDL组,差异有统计学意义(P<0.05),干预治疗组均高于sham组,差异亦有统计学意义(P<0.05)。2.3 Western Blot分析p-FAK/FAK:p-FAK/FAK在CBDL组呈逐渐上升的趋势,至第四周时达到高峰(0.72±±0.05),与sham组比较有明显差异(P<0.05).TNF-αMcAb干预治疗组与CBDL组的p-FAK/FAK整体变化趋势基本一致,各个时间点整体均较同周CBDL组的值低,且有明显的差异(P<0.05),而第一周(0.40±±0.04)、第四周(0.42±±0.03)与sham组(0.38±±0.06)比较无明显差异(P>0.05)。2.4 Western Blot分析PTEN:①CBDL组PTEN蛋白表达呈下降的趋势,于术后第2周最低(0.52±±0.03),3周时升高,此后又有所下降,均低于sham组(1.01±±0.02),差异有统计学意义(P<0.05).②TNF-αMcAb组治疗1周(0.62±±0.02)后与同时间的CBDL组相比较,即明显的升高,后三周干预治疗组亦高于CBDL组,差异有统计学意义(P<0.05),干预治疗组与sham组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论：1 HPS的发生过程中伴随着PTEN表达的明显降低,存在PTEN信号转导通路的改变,说明PTEN信号转导通路参与了HPS发生2 HPS的发生过程中伴随着FAK表达的明显增加,p-FAK水平增多,存在FAK信号转导通路的活化,说明FAK信号转导通路参与了HPS发生3 TNF-a McAb对HPS的治疗可能是通过FAK、PTEN等信号分子发挥作用。
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