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透明颤菌血红蛋白基因在β-甘露聚糖酶工程菌中的表达

作　者: 王俐琼
导　师: 周洪波；赵伟
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: 透明颤菌血红蛋白 基因合成 β-甘露聚糖 毕赤酵母
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


β-甘露聚糖酶(β-mannanase)是一类重要的半纤维素酶类,在食品加工、动物饲料、环境改造、传统的纺织业以及石油开发生产和生物技术等众多科研和工农业领域上得到多方面广泛的应用。本实验室郑甲等已设计构建了一株毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌,但其在高密度发酵中对氧的需求成为其工业化应用的瓶颈。而有研究表明,细菌属的透明颤菌在缺氧的条件下能大量的合成血红蛋白以供自己生长所需。在应用于重组蛋白和抗生素工业化生产的工程菌中,转入的透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)能起到促进细胞增长和提高产量的目的,特别是在供氧不足的条件下。因此,本文将优化的透明颤菌血红蛋白基因分别转入野生型毕赤酵母和产β-甘露聚糖酶的工程菌中进行表达,并研究外源血红蛋白的表达对菌体发酵产p-甘露聚糖酶的影响。主要实验流程、结果及结论简介如下：首先,对透明颤菌血红蛋白基因序列进行优化分析,分割成合适的引物序列后,探索基因拼接的最适浓度与最佳PCR程序,最终扩增得到所需的VHb基因序列。设计引物Y0和X10,其中Y0用于去除质粒pPICZa B的信号肽,X10用于在目的基因末端添加组氨酸标签。其次,将正确合成的透明颤菌血红蛋白基因优化序列电导入野生毕赤酵母中进行表达,发现在供氧不足的情况下,原始野生菌菌浓只能达到5.6×108/mL,而表达透明颤菌血红蛋白的毕赤酵母工程菌菌浓达到6.0×108/mL,证明透明颤菌血红蛋白在限氧条件下对毕赤酵母生长有延长其稳定期的作用。在氧充足的情况下,对菌株的生长基本没有影响。将透明颤菌血红蛋白大量表达后对其进行SDS-PAGE验证与镍离子亲和纯化。最后,将已合成的优化后透明颤菌血红蛋白基因导入毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌。分别用PCR、SDS-PAGE以及Western Blot对透明颤菌血红蛋白的表达进行验证。筛选出七株表达透明颤菌血红蛋白的β-甘露聚糖酶工程菌。与原始β-甘露聚糖酶工程菌进行比较,发现在供氧不足的条件下,前者菌浓能达到5.2×108/mL,而后者最高菌浓只有2.7×108/mL,表明透明颤菌血红蛋白的导入提高了菌体生长率,然而对其酶活影响不大。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 绪论  11-22
  1.1 β-甘露聚糖酶简介  11-14
    1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源  11-12
    1.1.2 β-甘露聚糖酶的酶学特性  12
    1.1.3 甘露聚糖酶的应用  12-14
  1.2 透明颤菌血红蛋白概述  14-17
    1.2.1 透明颤菌简述  14
    1.2.2 透明颤菌血红蛋白  14-15
    1.2.3 透明颤菌血红蛋白的结构与特征  15
    1.2.4 透明颤菌血红蛋白的功能  15
    1.2.5 透明颤菌血红蛋白的克隆、表达与调控  15-16
    1.2.6 VHb的作用机制  16-17
  1.3 VHb的分子生物学研究进展  17-18
  1.4 透明颤菌血红蛋白在工业生产中的应用  18-20
    1.4.1 在抗生素生产中的应用  18
    1.4.2 提高酶活及蛋白产量  18-19
    1.4.3 VHb在其它代谢产物的生产中的应用  19-20
  1.5 本研究的目的与意义  20-21
  1.6 主要实验思路  21
  1.7 课题来源  21-22
第二章 优化合成后的透明颤菌血红蛋白基因(VHB)及其在毕赤酵母中的表达  22-41
  2.1 前言  22
  2.2 材料与方法  22-31
    2.2.1 实验试剂  22-23
    2.2.2 主要仪器设备  23-24
    2.2.3 溶液配制  24
    2.2.4 培养基  24-25
    2.2.5 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的优化设计与合成原理与方法  25-28
    2.2.6 TA克隆方法  28
    2.2.7 重组去信号肽表达载体(pGAPZ B)的构建原理与方法  28-29
    2.2.8 毕赤酵母电转方法  29-30
    2.2.9 毕赤酵母菌落PCR方法  30-31
  2.3 结果与讨论  31-40
    2.3.1 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的优化设计与合成  31-36
    2.3.2 透明颤菌血红蛋白基因(VHB)的克隆与鉴定  36
    2.3.3 重组表达载体(pGAPZ B-VHB)的构建与鉴定  36-38
    2.3.4 毕赤酵母电转与重组子筛选  38
    2.3.5 重组酵母的PCR鉴定  38-39
    2.3.6 透明颤菌血红蛋白表达对毕赤酵母生长的影响  39-40
  2.4 本章小结  40-41
第三章 透明颤菌血红蛋白性质研究  41-50
  3.1 前言  41
  3.2 材料与方法  41-47
    3.2.1 实验主要试剂  41-42
    3.2.2 实验菌种与抗体  42
    3.2.3 溶液配制  42-43
    3.2.4 主要仪器和设备  43
    3.2.5 SDS-PAGE方法  43-45
    3.2.6 蛋白分离纯化方法  45-46
    3.2.7 免疫杂交分析方法  46-47
  3.3 实验结果与分析  47-49
    3.3.1 重组酵母的蛋白表达与SDS-PAGE检测  47
    3.3.2 透明颤菌血红蛋白分离纯化  47-48
    3.3.3 透明颤菌血红蛋白单抗筛选  48-49
  3.4 本章小结  49-50
第四章 透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌的影响  50-59
  4.1 前言  50
  4.2 材料与方法  50-52
    4.2.1 主要试剂  50
    4.2.2 主要仪器设备  50
    4.2.3 菌种、质粒来源  50
    4.2.4 生长曲线测定方法  50-51
    4.2.5 β-甘露聚糖酶酶活测定方法  51-52
  4.3 实验结果与讨论  52-58
    4.3.1 电转毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌与重组子筛选  52-53
    4.3.2 重组酵母表达产物分析与SDS-PAGE检测  53-55
    4.3.3 重组毕赤酵母透明颤菌血红蛋白的免疫杂交鉴定  55
    4.3.4 透明颤菌血红蛋白(VHB)表达对工程菌生长的影响  55-56
    4.3.5 透明颤菌血红蛋白(VHB)表达对工程菌酶活的影响  56-58
  4.4 本章小结  58-59
第五章 全文总结  59-61
参考文献  61-67
致谢  67-68
研究成果  68

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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