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鮸鱼Wap65-2基因的克隆及表达

作　者: 董培培
导　师: 陈炯
学　校: 宁波大学
专　业: 水产养殖
关键词: 鮸鱼 Wap65 克隆原核表达 Western blot
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 22次
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内容摘要

鮸鱼[Miichthys miiuy]为近海暖温水性中下层肉食性鱼类,是浙江沿海深水网箱养殖的重要养殖鱼类之一。然而,随着养殖密度的增加,水体环境的恶化,各种细菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病时有发生。Wap65蛋白是一种硬骨鱼类体内的类血红素结合蛋白,参与多个生理生化过程,是一种多功能蛋白,与温度适应、病原感染、重金属污染等多种外界环境应激相关。为了研究鮸鱼Wap65-2基因分子特征及其与细菌感染的相关性,本研究首先从鮸鱼肝cDNA文库中获得了Wap65-2基因的编码序列,并通过5′RACE获得其全长cDNA序列。鮸鱼Wap65-2基因cDNA序列全长1613个核苷酸,包含一个大的开放阅读框,推测编码一个由447个氨基酸组成的分子量为50.7kDa的蛋白。氨基酸序列比较表明,鮸鱼Wap65-2与斜带石斑鱼Wap65-2最相似,氨基酸序列同源性为70.4%。系统进化分析发现,鮸鱼Wap65-2基因与其它Wap65-2亚型基因形成一簇。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,哈维氏弧菌感染后,鮸鱼肝中Wap65-2基因mRNA的相对表达量显著增加(P<0.05),揭示Wap65-2可能参与鮸鱼细菌感染导致的急性期反应。此外,本研究构建了Wap65-2基因的原核表达重组质粒pET22b-Wap65-2,转化大肠杆菌BL21 pLys E菌株并经IPTG诱导后,获得了与预期大小一致的目的蛋白。目的蛋白切胶后免疫小鼠,获得鮸鱼Wap65-2多克隆抗体,Western blot检测能与目的蛋白起强的特异性反应。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-10
1 文献综述  10-21
  1.1 Wap65 分子结构及组织分布  11-14
    1.1.1 分子结构  11-13
    1.1.2 组织分布  13-14
  1.2 Wap65s 表达与环境温度的相关性  14-15
  1.3 Wap65s 表达与环境盐度的相关性  15
  1.4 Wap65s 表达与病原感染的相关性  15-18
    1.4.1 Wap65s 表达与细菌感染的相关性  16-17
    1.4.2 Wap65-2 蛋白表达与寄生虫吸附间的相关性  17-18
  1.5 Wap65s 表达与重金属胁迫的相关性  18-19
  1.6 小结  19-21
2 鮸鱼Wap65-2 基因序列分析  21-38
  2.1 材料与方法  21-28
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验试剂  21-22
    2.1.3 实验方法  22-28
  2.2 哈维氏弧菌感染后鮸鱼肝Wap65-2 基因mRNA 表达变化  28-31
    2.2.1 哈维氏弧菌菌悬液制备  29
    2.2.2 细菌感染并取样  29-30
    2.2.3 实时荧光定量PCR  30-31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 总 RNA 抽提和cDNA 文库构建  31
    2.3.2 Wap65-2 基因cDNA 序列  31-32
    2.3.3 Wap65-2 基因的氨基酸及系统进化分析  32-34
    2.3.4 哈维氏弧菌感染后鮸鱼肝Wap65-2 基因的mRNA 表达差异  34-35
  2.4 讨论  35-38
3 鮸鱼Wap65-2 的表达及抗血清制备  38-50
  3.1 外源基因的原核表达载体构建  38-41
    3.1.1 获得含有目的基因的克隆  38-39
    3.1.2 E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I 试剂盒(OMEGA)法纯化质粒  39
    3.1.3 对纯化的质粒以及原核表达载体进行双酶切  39-40
    3.1.4 切胶纯化  40
    3.1.5 连接  40
    3.1.6 转化  40-41
  3.2 外源基因的原核表达  41-42
    3.2.1 纯化目的质粒  41
    3.2.2 转化  41
    3.2.3 诱导  41
    3.2.4 检测  41-42
    3.2.5 染色与脱色  42
  3.3 抗血清的制备  42-43
    3.3.1 纯化目的蛋白  42-43
    3.3.2 制备抗血清  43
  3.4 Western blot  43-45
  3.5 实验结果  45-48
    3.5.1 Wap65-2 基因载体构建及酶切鉴定  45-46
    3.5.2 原核表达载体的构建及酶切鉴定  46-47
    3.5.3 鮸鱼Wap65-2 基因的原核表达及抗血清检测  47-48
  3.6 讨论  48-50
4 结论  50-52
  4.1 研究成果  50
    4.1.1 克隆了鮸鱼Wap65-2 基因  50
    4.1.2 Wap65-2 原核表达并制备抗血清  50
  4.2 展望  50-52
参考文献  52-59
在学研究成果  59-61
致谢  61

鮸鱼Wap65-2基因的克隆及表达

内容摘要

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