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穿心莲二萜环合酶基因的克隆与原核表达

作　者: 姚攀
导　师: 徐晖
学　校: 广州中医药大学
专　业: 药物分析学
关键词: 穿心莲二萜环合酶 ent-焦磷酸古巴酯合成酶克隆 cDNA末端快速扩增技术原核表达
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

1目的穿心莲来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees的干燥地上部分,为常用大宗中药材。穿心莲内酯类成分是穿心莲的主要药效活性成分,是在穿心莲植物体中通过一个非常复杂的生物合成途径而形成的。穿心莲ent-焦磷酸古巴酯合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase,简称ApCPS),二萜环合酶的一种,是参与这个生物合成途径的一个关键酶,决定了穿心莲内酯的母核结构。ApCPS催化焦磷酸香叶基香叶酯(C20焦磷酸,geranylgeranyl diphosphate, GGDP)环合形成ent-焦磷酸古巴酯(ent-copalyl diphosphate, ent-CDP),后者经过一系列的衍生化反应,最终得到各种穿心莲内酯类成分。通过同源基因克隆得到ApCPS的基因序列并鉴定其生物学功能,不仅有助于阐明穿心莲内酯的生物合成途径,而且也为将来利用该基因调控穿心莲内酯的生物合成,提高穿心莲的药效打下了基础。2方法2.1穿心莲CPS基因核心片段的克隆根据GenBank公布的穿心莲CPS基因部分序列(AJ9731191)设计特异性引物,以穿心莲叶片总RNA为模板通过反转录PCR克隆得到穿心莲CPS基因核心片段,测序。2.2穿心莲CPS基因3’末端和5’末端片段的克隆根据核心片段的序列,应用cDNA末端快速扩增技术[5’RACE和3’RACE)’快速扩增穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)的3’末端和5’末端基因片段。2.3克隆质粒的构建,测序全长序列分析将3’RACE和5’RACE产物回收、纯化后分别连接T载体,转化E. coli DH5a感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性筛选、蓝白筛选,并通过酶切验证、序列比对等方法筛选和鉴定阳性重组子。最后用软件将核心片段、3’末端和5’末端的序列拼接成穿心莲CPS基因cDNA全长序列,进行序列分析。2.4穿心莲CPS基因全长cDNA片段的克隆根据拼接得到的全长序列,结合拟采用的原核表达载体pGEX-4T-3的多克隆位点,设计引物(5’端引物含有BamHⅠ酶切位点,3’端引物含有SmaⅠ酶切位点)。以RNA为模板进行反转录,然后使用高保真聚合酶扩增获得ApCPS基因。2.5原核表达质粒的构建PCR纯化产物进行双酶切(BamH I/Sma I)处理,回收酶切产物,连接到经过相同酶酶切处理的原核表达载体pGEX-4T-3,转化E. coli DH5a感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性筛选转化子,并通过酶切验证、序列比对等方法筛选和鉴定阳性重组子。2.6融合蛋白的表达将携带穿心莲CPS基因的原核表达质粒分别转化宿主菌E. coli JM109、E. coli BL21 (DE3) pLysS和E. coli XLI-Blue,通过氨苄青霉素、氯霉素抗性筛选以及酶切验证获得阳性菌落；接种单菌落,用IPTG进行诱导表达,并用SDS-PAGE对蛋白表达结果进行分析。3结论3.1穿心莲CPS基因核心片段的克隆根据琼脂糖凝胶电泳结果,PCR产物与预期一致,可初步判断成功扩增穿心莲CPS基因核心片段,长度为373bp。3.2穿心莲CPS基因3’末端和5’末端片段的克隆酶切和测序结果表明,成功构建了携带穿心莲CPS基因的克隆质粒pMDTM19-apCPS (3’RACE)和pMDTM19-apCPS (5’RACE).通过BLASTX检索,pMDTM19-apCPS (3’RACE)中,DSC36 3’端基因核苷酸序列与GenBank登记的咖啡CPS基因序列一致性为62%(GenBank登记号：ACQ99373.1); pMDTM19- apCPS (5’RACE)中apCPS 5’端基因核苷酸序列与野甘草copalyl diphosphate基因序列(GenBank登记号：AB046689.1)的一致性为55%。3.3穿心莲CPS基因全长cDNA片段的克隆琼脂糖凝胶电泳表明通过反转录PCR克隆得到全长为2.5kb的穿心莲CPS基因全长cDNA片段。ApCPS基因序列翻译得到氨基酸序列与野甘草copalyl diphosphate基因氨基酸序列(GenBank登记号：BAB03594.1)同源性为60%。3.4原核表达质粒的构建酶切和测序结果表明,成功构建了携带穿心莲CPS基因的原核表达质粒pGEX-apCPS,开放阅读框正确,编码833个氨基酸,分子量为95kDa,与野甘草putative copalyl diphosphate synthase氨基酸序列(GenBank登记号：BAD91286.1)同源性为64%；与野甘草copalyl diphosphate氨基酸序列(GenBank登记号：BAB03594.1)同源性为60%。3.5融合蛋白的表达SDS-PAGE分析结果显示,携带原核表达质粒pGEX-apCPS的大肠杆菌E. coli JM109、E. coli BL21 (DE3) pLysS和E. coli XLI-Blue经IPTG诱导表达后,没有表达预期大小为融合蛋白(121.4 KDa),而阴性对照表达出26 KDa的GST标记蛋白。4结论成功克隆了穿心莲CPS基因,并且构建了原核表达质粒pGEX-apCPS,为穿心莲CPS基因的原核表达和功能鉴定奠定了基础。然而,穿心莲CPS基因在大肠杆菌中的原核表达没有成功。从携带ApCPS全长cDNA的E. coli JM109、E.coli BL21(DE3) pLysS和E. coli XLI-Blue三种菌株诱导表达的实验结果看,没有表达出预期大小融合蛋白,究其原因可能是真核基因的5’端的信号肽及其它非功能序列影响了其在原核细胞中的转录及翻译,后续研究可以尝试只对其功能区域进行表达；也有可能是目的蛋白存在细胞毒性或自身不稳定性,只在特定条件下表达,因此有必要对培养条件作进一步优化。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-16
引言  16-26
  1 研究背景  16-23
    1.1 穿心莲的基本概况  16
    1.2 穿心莲内酯类成分研究  16-17
    1.3 穿心莲二萜环合酶基因的研究  17
    1.4 植物萜类化合物生物合成途径  17-19
    1.5 萜类环合酶  19-20
    1.6 植物基因的克隆  20-22
    1.7 大肠杆菌中真核基因表达  22-23
    1.8 小结  23
  2 本研究工作的总体思路、主要研究方法和预期结果  23-24
  3 本研究工作技术路线图  24-26
第一章穿心莲二萜环合酶基因(APCPS)的克隆  26-54
  1 材料与方法  26-42
    1.1 材料  26-30
    1.2 方法  30-42
  2 结果与分析  42-51
    2.1 穿心莲RNA提取  42-43
    2.2 穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)核心片段的克隆  43-44
    2.3 穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)3’末端的克隆  44-47
    2.4 穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)5’末端的克隆  47-49
    2.5 穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)全长克隆  49-51
  3 讨论  51-52
    3.1 ApCPS基因片段(核心片段、3’末端和5’末端)的扩增策略及结果  51-52
    3.2 对ApCPS基因cDNA全长克隆的策略及结果  52
  4 结论  52-54
第二章穿心莲二萜环合酶基因(APCPS)的原核表达  54-72
  1 材料与方法  54-60
    1.1 材料  54-56
    1.2 方法  56-60
  2 结果与分析  60-68
    2.1 穿心莲二萜环合酶基因(ApCPS)片段的克隆  60
    2.2 构建重组质粒pGEX-apCPS  60-62
    2.3 测序和序列分析  62-64
    2.4 ApCPS基因的原核表达  64-68
  3 讨论  68-71
    3.1 构建克隆质粒和表达质粒的策略  69
    3.2 阳性重组子的鉴定  69
    3.3 测序结果的分析  69-70
    3.4 大肠杆菌的诱导表达  70-71
  4 结论  71-72
结语  72-73
参考文献  73-76
附录Ⅰ 相关试剂盒使用说明  76-98
  附录Ⅰ-1:RNAiso~(TM) Plus(Total RNA提取试剂)使用说明  76-81
  附录Ⅰ-2:iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)反转录试剂盒使用说明  81-83
  附录Ⅰ-3:Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)DNA凝胶回收试剂盒使用说明  83-85
  附录Ⅰ-4:3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa)使用说明  85-88
  附录Ⅰ-5:PrimcScript~(TM)反转录PCR Kit(TaKaRa)反转录试剂盒使用说明  88-90
  附录Ⅰ-6:SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)使用说明  90-93
  附录Ⅰ-7:PrimeScript~(TM) 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)使用说明  93-96
  附录Ⅰ-8:GeneJET~(TM) Plasmid Miniprep Kit(Fermentas)质粒提取试剂盒使用说明  96-98
附录Ⅱ序列比对和BLAST结果  98-140
  附录Ⅱ-1:穿心莲(CPS)基因AJ973129使用Blastx进行序列比对  98-100
  附录Ⅱ-2:穿心莲CPS基因核心片段使用apCPS-F1和apCPS-R1引物双向测序结果用Clustalw进行比对  100-102
  附录Ⅱ-3:使用Blastn对使用apCPS-F1引物测序的穿心莲CPS核心片段基因进行分析  102-103
  附录Ⅱ-4:穿心莲CPS基因3'RACE产物片段两个样测序结果用Clustalw进行比对  103-107
  附录Ⅱ-5:穿心莲CPS基因3'RACE产物DNA片段测序结果用Blastx分析  107-111
  附录Ⅱ-6:穿心莲CPS基因5'RACE产物片段取两个样测序结果用Clustalw进行比对  111-113
  附录Ⅱ-7:穿心莲CPS基因5'RACE产物DNA片段测序结果用Blastx分析  113-115
  附录Ⅱ-8:穿心莲CPS基因全长拼接序列的翻译及序列分析  115-121
  附录Ⅱ-9:穿心莲CPS基因全长拼接序列和CPS基因的测序结果用Clustalw进行比对  121-126
  附录Ⅱ-10:穿心莲CPS基因编码区翻译得到蛋白序列  126-127
  附录Ⅱ-11:用Blastp对穿心莲CPS基因编码区翻译得到蛋白序列进行分析  127-134
  附录Ⅱ-12:用Clustalw对穿心莲CPS基因序列和一致性最高的其它五种CPS基因进行比对  134-140
附录Ⅲ 本研究工作中涉及的菌株和质粒  140-141
在学期间发表的论文  141-142
致谢  142

穿心莲二萜环合酶基因的克隆与原核表达

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