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Mycobacterium tuberculosis铁载体合成相关基因Rv1345（fadD33）的过表达对宿主菌生理功能的影响研究

作　者: 贺君丽
导　师: 谢建平
学　校: 西南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 结核分枝杆菌 FadD33 铁载体
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结核病至今仍是一种严重危害人类健康的传染病。全球近1/3的人口感染过其致病菌——结核分枝杆菌。人们对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)进行了广泛研究,使得人类对结核病的控制取得了可喜的成绩,一定程度上遏制了结核病的蔓延和传播。然而由于医患不规范不合理用药、艾滋病与结核病联合感染、人口流动的增加以及耐药结核病菌的流行,使得近年来结核病疫情下降缓慢,在部分地区甚至有所回升。全球每年新发结核病数量仍在增长,尤其是非洲地区、地中海东部和东南亚地区。当前,在结核病控制工作中急需开发出有效的预防性、治疗性疫苗和新型药物。寻找新的结核药物作用靶点和开发新型抗结核药物已成为当前科研领域最为关注的热点。铁离子是生命活动的必需元素,是各种生命活动重要酶的辅因子,如氧化酶、羟化酶、参与氧原子传递的酶等；参与氧化磷酸化和能量供应的细胞色素也需要铁离子。缺失铁离子会导致重大的有机体生理功能缺陷。铁离子对致病菌同样重要。然而,宿主体内,尤其是胞内,铁离子很有限,因此,病原菌,如主要栖居在单核巨噬细胞中的结核菌,只有成功获取宿主中的铁离子才能成功感染和繁殖。铁载体是一种小分子螯合剂,对铁离子具有很高的亲和力,是致病菌获取铁离子的重要工具。研究表明,铁载体与微生物的存活和致病性密切相关。例如,在缺铁环境中,缺失铁载体的铜绿假单胞菌生长严重受抑,即使感染了烧伤小鼠,也不具有毒性；在巨噬细胞中,不能合成铁载体分支菌素的结核分枝杆菌生长严重受抑制。此外,铁载体的合成还对分枝杆菌抗氧化压力有关。鉴于铁载体对MTB的重要作用,铁载体已成为寻找抗结核药物先导物的重要“模特”,已获得了一些有潜力的抗菌/抑菌组分。结核分枝杆菌铁载体有水溶性的羧化分支菌素和细胞壁相关的分支菌素两种,前者被分泌到胞外掠夺宿主的铁离子,转递给细胞壁上的分支菌素,再被转递进胞内满足自身生理需要。结核分枝杆菌铁载体的合成需要一系列酶的联合作用。目前,虽然铁载体生物合成的总体框架已经勾勒出来,但结核分枝杆菌Rv1344、fadD33和fadE14是否是分支菌素(mycobactin)生物合成基因簇成员尚存在争议。Krithika等认为Rv1345 (FadD33)是结核分枝杆菌铁载体生物合成酶之一,主要负责激活铁载体尾链合成所需的脂肪酸基序。另外,有研究证明FadD33利于MTB在肝脏及肝癌细胞系中的生长和毒力。探索MTB FadD33对铁载体合成和分泌的影响及其对宿主菌其他生理功能的影响,有助于完善对结核分枝杆菌铁载体合成机制的认识,为抗结核药物设计提供信息。本文主要将MTB H37Rv的分支菌素/羧化分支菌素合成基因fadD33 (Rv1345)分别在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中进行克隆表达并研究其对宿主菌的生长、抗氧化压力、铁载体分泌以及脂肪酸构成的影响。从GenBank数据库中获得M.tuberculosis H37Rv fadD33 (Rvl345)的核苷酸序列,设计引物,以MTB H37Rv全基因组为模板,体外扩增获得fadD33 (Rv1345)基因。Ⅰ)在Escherichia Coli中,我们通过TA克隆,将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector,然后亚克隆至载体pET32a(+),经菌落PCR、质粒酶切以及序列测定证明pET32-Rv1345重组质粒构建成功。接着,我们研究了过表达FadD33对E. Coli生长能力、抗H202能力和铁载体分泌能力的影响。实验结果显示FadD33的过表达有利于重组大肠杆菌的生长,但是对E.Coli抗氧化压力和铁载体合成分泌能力无显著影响。Ⅱ)在M. smegmatisMC2155中,我们通过TA克隆将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector后,再克隆至穿梭质粒pNIT-myc中,经质粒抽提、PCR验证、双酶切验证以及测序证明重组质粒pNIT-myc-Rv1345构建成功。接着,我们研究了FadD33过表达对耻垢分枝杆菌抗氧化压力、生长和铁载体分泌的影响。最后,我们通过GC检测了重组菌与空载对照的脂肪酸组成。实验结果显示：FadD33过表达对耻垢分枝杆菌抗氧化压力的影响不显著,但能促进其生长和铁载体分泌；重组耻垢分枝杆菌和空载对照的脂肪酸组分存在较大差异。

Mycobacterium tuberculosis铁载体合成相关基因Rv1345（fadD33）的过表达对宿主菌生理功能的影响研究

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