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软骨损伤后基质细胞衍生因子-1表达及其意义

作　者: 陆定贵
导　师: 韦庆军
学　校: 广西医科大学
专　业: 创伤骨科
关键词: 软骨损伤基质细胞骨髓 BrdU 贴壁培养间充质干细胞密度梯度离心细胞表面标记趋化细胞活性标记率荧光显微镜分离培养软骨细胞标记法归巢酶联免疫法性因子干细胞研究 SDF
分类号: R681.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,用BrdU标记骨髓间充质干细胞,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。主要观察指标：台盼蓝染色观察密度梯度离心后细胞活性,倒置相差显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞的形态变化；流式细胞仪检测兔骨髓间充质干细胞的表面标记；绘制兔骨髓间充质干细胞生长曲线,骨髓间充质干细BrdU标记率及标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的兔骨髓间充质干细胞,分离后细胞活性均大于99%。流式细胞仪检测兔骨髓间充质干细胞CD90,CD45,CD34阳性细胞表达分别为99.24%,0.03%,1.37%。兔骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形。免疫荧光试验检测BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光,标记率>95%, BrdU标记后,细胞活性高,BrdU细胞标记最佳时间为48h,最佳浓度为10μg/mL。结论：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法；BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法,BrdU对细胞标记率及安全性高。目的：研究骨髓间充质干细胞趋化聚集软骨损伤病灶的可能机制,为调控和干预软骨损伤时干细胞定向迁移和聚集提供理论和实验依据。方法：制作兔软骨损伤模型,分别于制模后2、5、7、10、14、28天处死兔子,取损伤灶及边缘区组织,利用组织裂解液提取总蛋白,分别行酶联免疫法夹心法检测基质细胞源性因子1表达和体外细胞迁移实验,部分兔软骨损伤制模成功后,行细胞体内移植,观察基质细胞源性因子1对MSCs的迁移影响。结果：基质细胞源性因子1的表达呈现出时间变化的趋势,制模后7天达到高峰水平。制模后的软骨组织对MSCs迁移的影响与SDF-1的表达呈相同的变化程序,制模后7天对MSCs的趋化作用最强。SDF-1存在时,MSCs迁移活跃,应用抗体封闭CXCR4后,这种迁移显著减弱。体内移植的MSCs主要聚集在损伤灶周围,但在封闭CXCR4后,这种聚集现象大大减弱。结论：软骨损伤的早期,损伤灶内修复组织中基质细胞源性因子1的表达明显升高,并可在损伤后2周内维持在一个相对高的水平,软骨损伤灶内基质细胞源性因子1表达量上调是吸引骨髓干细胞归巢的可能机制之一,通过调节基质细胞源性因子1及其受体CXCR4对MSCs的趋化作用,可望调控干细胞向靶组织的趋化聚集量,达到治疗目的。

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部分中英文词汇索引  4-5
第一部分兔骨髓间充质千细胞的分离培养及Brdu标记的体外研究  5-8
  摘要  5-6
  ABSTRACT  6-8
第二部分软骨损伤后基质细胞衍生因子-1 的表达及其意义  8-11
  摘要  8-9
  ABSTRACT  9-11
前言  11-14
第一部分兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究  14-41
  材料  14-16
  实验路线  16
  实验方法  16-25
  结果  25-28
  附图  28-34
  讨论  34-40
  小结  40-41
第二部分软骨损伤后基质细胞衍生因子-1的表达及其意义  41-56
  材料  41-42
  实验路线  42
  实验方法  42-48
  结果  48-52
  讨论  52-55
  小结  55-56
参考文献  56-60
综述骨髓间充质干细胞与关节软骨修复  60-70
  参考文献  67-70
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  70-71
致谢  71

软骨损伤后基质细胞衍生因子-1表达及其意义

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