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IL-8介导血管平滑肌细胞迁移机制及G31P的作用初探

作　者: 孙云亮
导　师: 高颖
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: IL-8 G31P A7r5细胞动脉粥样硬化细胞迁移趋化因子
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)导致的心脑血管疾病是人类健康的最大杀手,在我国的发病率逐年升高。近年来的研究表明AS是一种炎症性疾病,大量的炎症细胞和炎性因子伴随在其发生和发展过程的始终。炎症细胞参与AS表现为在损伤部位有大量炎症细胞的粘附、浸润,并且释放大量的炎性因子,趋化白细胞穿过血管内膜,诱导平滑肌细胞表型改变,继而迁移进入内膜并进行增殖。这些细胞进入内膜后,开始吞噬脂质形成泡沫细胞,加速AS的发展。趋化因子是一类具有趋化作用的小分子量分泌型蛋白,可以诱导白细胞进入血管内膜,在AS中发挥重要作用。白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)是一种单核/巨噬细胞分泌的多肽,通过与其受体CXCR1/CXCR2结合从而启动中性粒细胞趋化反应。IL-8还能够诱导人主动脉血管平滑肌细胞迁移和增殖;并且可以促进AS中新生血管形成,但其具体机制尚不清楚。抑制IL-8与其受体结合为治疗AS提供了新的思路。G31P是通过对人IL-8基因的定点突变,筛选的出高亲和力,无活性的人IL-8类似物。通过实验证实了G31P可以高效的亲和CXCR1/CXCR2,对与中性粒细胞相关的感染治疗上有明显的疗效。G31P对中性粒细胞CXCR1/CXCR2的有效抑制作用能否发生在血管平滑肌细胞中尚未有研究。方法:(1)利用RT-PCR的方法检测A7r5细胞中是否有IL-8的受体之一CXCR2的表达;(2)利用Boyden Chamber法观察IL-8和G31P对A7r5细胞迁移的影响;(3)利用划痕法和Boyden Chamber法观察G31P在IL-8诱导A7r5细胞迁移过程中的影响;(4)利用细胞免疫荧光方法观察细胞骨架变化情况;(5)利用钙离子荧光探针Fluo-3 AM检测IL-8与G31P对A7r5细胞内钙离子浓度的影响。结果:(1)RT-PCR结果显示A7r5细胞中有CXCR2的表达;(2)IL-8诱导A7r5细胞迁移实验结果显示,随着IL-8浓度的增加,细胞迁移数呈现上升趋势,IL-8浓度为20ng/ml、50ng/ml两组的细胞迁移数较其它各组有统计学意义,但这两组之间差异无统计学意义。随着G31P浓度的增加,迁移的细胞数并未发生明显变化,各组间的差异无统计学意义。(4)划痕和迁移实验结果显示了细胞平均迁移距离与相对迁移数量两项统计值的变化情况,只用G31P处理的阴性对照组与空白对照组比较,两项统计值的变化均无统计学意义。只用IL-8诱导的阳性对照组与空白对照组比较,两项统计值的变化均有统计学意义(p<0.01)。G31P抑制组与空白对照和G31P阴性对照组比较,两项统计值的变化无统计学意义;与IL-8阳性对照比较,两项统计值的变化有统计学意义(p<0.01)。(5)免疫荧光实验结果显示,随着IL-8浓度增加,细胞伪足伸出明显增加,呈剂量依赖趋势。与未用G31P预处理、IL-8终浓度为20ng/ml组的细胞相比,在用G31P预处理后再用IL-8刺激,可观察到细胞伪足的伸出不明显。(6)细胞内钙离子浓度测定结果显示,随着IL-8浓度的增加(0-100ng/ml)细胞内钙离子的荧光强度逐渐增加,呈现剂量依赖趋势,与对照组相比有统计学意义。与用同样浓度的IL-8刺激组相比,用G31P预处理的细胞、再用IL-8刺激后,其细胞内钙离子的荧光强度变弱,有统计学意义。结论:(1)IL-8可以诱导A7r5细胞的迁移、细胞伪足伸出、细胞内钙离子浓度升高,具有剂量依赖性。(2)G31P可以有效抑制IL-8对A7r5细胞的诱导作用。(3)IL-8对A7r5细胞的诱导作用可能通过调节细胞膜钙离子通道进而调节细胞功能。

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摘要 6-8Abstract 8-10前言 10-11材料和方法 11-19结果 19-25讨论 25-27结论 27-28参考文献 28-30综述 30-39 参考文献 34-39致谢 39

IL-8介导血管平滑肌细胞迁移机制及G31P的作用初探

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