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分子佐剂C3d3增强Lb.hCGβ-C3d3乳酸杆菌粘膜疫苗抗生育潜能的分子机制

作　者: 王健理
导　师: 姚晓英
学　校: 复旦大学
专　业: 妇产科学
关键词: 重组乳酸杆菌 hCGβ 分子佐剂C3d3 阴道黏膜免疫 CCL25 归巢 粘附分子 E-钙粘蛋白 E-选择素
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


免疫避孕疫苗作为一种新的节育措施近年来越来越受关注,其中以hCGβ为基础的避孕疫苗是近年来研究得最为成熟的一种；通过在生育期妇女体内诱导产生抗hCGβ体液免疫以中和hCG生物学活性,从而发挥抗生育作用。升调节淋巴细胞归巢到生殖道黏膜局部,将有利于增强粘膜体液免疫效应,从而有助于提高避孕疫苗的避孕效果。我们实验室前期成功构建了分泌hCGβ及携分子佐剂C3d3的hCGβ-C3d3融合蛋白重组乳酸杆菌。并已研究证明,通过黏膜接种BALB/c小鼠,能产生抗hCGβ体液免疫应答,但其抗生育作用尚不能完全肯定。因此本实验拟对这种表达hCGp-C3d3融合蛋白重组乳酸杆菌的抗生育潜能,及其免疫后淋巴细胞归巢机制进行研究,为其最终应用于临床以及提高其有效性提供实验依据。第一部分重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3阴道黏膜免疫的抗生育潜能目的探讨表达hCGβ-C3d3融合蛋白的重组乳酸杆菌疫苗经阴道黏膜接种BALB/c小鼠及其抗生育潜能。方法用野生型乳酸杆菌Lb.及重组乳酸杆菌Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3以两种剂量(109个和1010个)经阴道滴注接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠。3周后用相同剂量加强免疫一次。于初次免疫后的第6、7、8周分别收集血清；用该血清分别处理MLTC-1、BeWo细胞系,及原代人绒毛滋养细胞；化学发光法检测培养上清中孕酮或hCGβ水平；ELISA检测培养上清中的hPL水平；免疫荧光观察抗血清处理的BeWo细胞融合情况。结果用1010个Lb.hCGβ-C3d3阴道黏膜免疫BALB/c小鼠产生的抗血清能显著抑制hCG刺激MLTC-1分泌孕酮及人滋养细胞分泌hCGβ和hPL,明显抑制BeWo细胞分泌hCGβ及细胞融合。结论重组乳酸杆菌活疫苗Lb.hCGβ-C3d3经阴道接种诱导的hCGβ抗体可拮抗hCGβ生物学活性,并干扰合体滋养细胞形成,因此具有抗生育潜能。第二部分分子佐剂C3d3促进阴道粘膜免疫中淋巴细胞归巢目的探讨表达hCGβ-C3d3融合蛋白的重组乳酸杆菌活疫苗经阴道黏膜接种后分子佐剂C3d3促进淋巴细胞归巢的分子机制。方法用野生型乳酸杆菌Lb.及重组乳酸杆菌Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3以1010个菌的剂量经阴道滴注接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠。3周后用相同剂量加强免疫一次。于加强免疫后第二周,以免疫磁珠分离免疫鼠的脾脏T、B淋巴细胞,经体外荧光标记后,分别经尾静脉过继转输给加强免疫后第二周的免疫小鼠。过继转输后96h,以双光子共聚焦显微镜观察转输细胞在各免疫组宿主鼠子宫阴道的归巢情况；Western blot分析加强免疫后第二周各免疫组子宫和阴道组织E-钙黏蛋白和E-选择素的表达。结果在过继转输的T、B淋巴细胞24h后,CFSE绿色荧光示踪的T、B细胞均能归巢到宿主子宫内膜,并呈时间依赖性,在过继转输后96h归巢的细胞数最多：但未发现阴道组织明显免疫活性细胞归巢。在重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3免疫组,荧光标记的T、B淋巴细胞归巢至小鼠子宫内膜明显增加；在腹腔注射抗CCL25中和性抗体后,宿主小鼠子宫内膜中CFSE荧光标记的B淋巴细胞数量显著减少,而荧光标记的T淋巴细胞数量减少不明显。和Lb.及Lb.hCGβ免疫组相比,Lb.hCGβ-C3d3免疫组的小鼠子宫和阴道组织的E-钙黏蛋白和E-选择素的表达量均明显增加。结论在重组乳酸杆菌经阴道黏膜免疫后,分子佐剂C3d3增加淋巴细胞对子宫内膜的归巢；趋化因子CCL25介导B淋巴细胞归巢到子宫局部。分子佐剂C3d3通过增加子宫阴道局部E-cadherin、E-selectin表达,有利于淋巴细胞粘附定居于生殖道,增强黏膜免疫体液应答。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-11
第一部分 重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3阴道接种BALB/c小鼠的抗生育潜能  11-20
  材料和方法  11-14
  结果  14-17
  讨论  17-20
第二部分 分子佐剂C3d3促进阴道粘膜免疫中淋巴细胞归巢的机制  20-32
  材料和方法  20-24
  结果  24-28
  讨论  28-32
结论  32-33
参考文献  33-38
致谢  38-39
附录1 英文缩略语  39-40
附录2 硕士期间发表的论文和论著  40-41
综述  41-45
研究生期间完成的论文  45-49

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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