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RNA干扰技术在绞股蓝鲨烯合酶基因功能研究中的应用

作　者: 李科志
导　师: 吴耀生
学　校: 广西医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 绞股蓝三萜皂苷 RNA干扰鲨烯合酶
分类号: S567.237
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要

本研究采用RNA干扰(RNAi)技术,设计了能在植物体内表达的具有阻断绞股蓝生物合成中关键酶之一鲨烯合酶(SS)基因转录功能的干扰载体,并将此载体成功转入绞股蓝中。为进一步研究三萜皂苷生物合成途径及其可能的分子调控机制奠定基础。主要研究结果如下:①绞股蓝总RNA提取和纯化。运用改良的CTAB法提取绞股蓝总RNA,获得了纯度高且完整的总RNA,可以直接用于后续RT-PCR。②对绞股蓝鲨烯合酶基因(SS)进行序列分析,从同源片段选择、发卡结构设计、内含子的选择、启动子的选择等多角度考虑,设计了中间载体pMD-190及SS基因干扰载体pBIISS-1\ pBIISS-s1-s2。③在本实验已构建的绞股蓝组培平台的基础上,通过改变激素组成和光照等因素诱导获得了绞股蓝的愈伤组织,但愈伤组织的再分化未能取得成功。④同时摸索了绞股蓝微量注射法导入以农杆菌为介导的外源基因的条件,并获得了能通过PCT检测到外源基因表达的绞股蓝植株。⑤根据已知植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)序列同源比对结果设计简并引物,以cDNA为模板,经PCR扩增、克隆获得绞股蓝GAPDH的部分片段。扩增所得的绞股蓝GAPDH保守序列可用于后期荧光定量PCR分析。本研究首次将RNA干扰技术应用于绞股蓝,同时也是首次利用基因沉默手段对三萜皂苷生物合成途径关键酶基因进行研究。这对深入了解绞股蓝三萜皂苷生物合成途径及其调控的分子机制,明确三萜皂苷合成途径功能酶鲨烯合酶与最终皂苷产量之间的关系,从而在分子水平上实现三萜皂苷生物合成的人工调控,提高其有效成分三萜皂苷的含量,具有重要的意义。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
前言  8-12
第一篇绞股蓝鲨烯合酶基因沉默表达载体的构建  12-53
  一、沉默载体的设计  12-21
  二、材料和方法  21-39
  三、实验结果  39-50
  四、讨论  50-53
第二篇绞股蓝受体系统的获得及转鲨烯合酶沉默基因的初步研究  53-69
  一、材料和方法  54-62
  二、实验结果  62-66
  三、讨论  66-69
小结  69
本研究的创新点及意义  69-70
参考文献  70-76
课题综述  76-90
  参考文献  87-90
附注  90-91
致谢  91-92
攻读学位期间发表的文章  92

RNA干扰技术在绞股蓝鲨烯合酶基因功能研究中的应用

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