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龙牙楤木三萜皂苷生物合成途径中相关基因的研究

作　者: 成慧
导　师: 吴颖
学　校: 吉林大学
专　业: 植物学
关键词: 龙牙楤木鲨烯合酶基因齐墩果酸基因表达 HPLC
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

龙牙楤木(Aralia elata ( Miq.) Seem)为五加科楤木属的落叶小乔木,传统中草药,根皮、茎皮、叶和嫩芽入药,主要药效成分为齐墩果酸,具有保肝的作用。但龙牙楤木人工栽培周期很长,野生资源完全不能满足临床需求。随着我国提出并实施了“中药基因组计划”,基因工程技术在解决药用植物资源等方面展现出广阔的应用前景。因此,通过生物技术的手段提高龙牙楤木次生代谢产物含量,势在必行。本研究首先克隆到了龙牙楤木三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因——鲨烯合酶基因,全长1245bp,编码414个氨基酸,将所得序列登录GenBank数据库,登录号为GU354313,生物信息学分析表明SS基因具有完整的开放阅读框,通过比对分析发现龙牙楤木SS基因的氨基酸序列与人参、西洋参、三七、柴胡、甘草和拟南芥同源性分别为95%、91%、96%、83%、89%和72%,同时构建了SS基因的系统进化树。另外生物信息学结果也表明该蛋白为疏水性的膜结合蛋白,本研究又成功构建了原核表达载体pET-28a-AeSS,转化BL21菌株进行原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,证明鲨烯合成酶基因在BL21菌株中表达成功。本研究成功构建了植物表达载体pBI121-AeSS,采用叶盘转化法,利用农杆菌侵染烟草,分子检测初步证明SS基因成功整合进了烟草基因组DNA中;同时成功构建了酵母表达载体pPIC9K-AeSS,采用电转化法转化酵母,通过分子检测证明SS基因成功整合进了酵母基因组DNA中,SDS-PAGE检测分析发现SS基因在毕赤酵母GS115菌株中表达成功。本研究以根、茎、叶为外植体,设计了60余个培养基诱导愈伤组织的形成,筛选出4个优良培养基,获得了大量愈伤组织,并通过HPLC法测定龙牙楤木侧根、茎、叶、愈伤中的齐墩果酸含量。结果表明:愈伤组织中的齐墩果酸含量最高,茎和叶的含量相近,侧根含量最低。同时还利用Real-time PCR对SS基因在侧根、茎、叶、花中的表达水平进行了分析,分析结果表明:SS基因在茎中的表达量最高,叶次之,侧根最低。HPLC和Real-time PCR的结果表明,SS基因在不同器官表达量的差异与代谢终产物齐墩果酸在该器官的含量有着一定的关联。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-14
第1章文献综述  14-32
  1.1 龙牙楤木的研究概况  14-20
    1.1.1 龙牙楤木的简介  14-16
    1.1.2 龙牙楤木的价值  16-17
    1.1.3 龙牙楤木的资源情况以及弥补办法  17-20
  1.2 龙牙楤木主要活性成分三萜皂苷的研究概况  20-22
    1.2.1 皂苷的研究概况  20-21
    1.2.2 龙牙楤木的化学成分  21-22
  1.3 龙牙楤木的药理作用  22-25
    1.3.1 保肝作用  22-23
    1.3.2 对心血管系统的作用  23-24
    1.3.3 抗癌作用  24
    1.3.4 抗衰老、降血糖血脂的作用  24-25
  1.4 植物三萜皂苷代谢途径  25-32
    1.4.1 龙牙楤木代谢途径的研究进展  25-26
    1.4.2 鲨烯合酶基因的研究进展  26-30
    1.4.3 本研究的目的和意义  30
    1.4.4 展望  30-32
第2章鲨烯合酶基因的克隆与原核表达  32-66
  2.1 材料与仪器  32-36
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 菌株与质粒  32-33
    2.1.3 酶和生化试剂  33-34
    2.1.4 实验所需试剂及培养基的配制  34-36
    2.1.5 特异和简并引物  36
    2.1.6 仪器  36
  2.2 方法  36-51
    2.2.1 龙牙楤木高质量总RNA 的提取  36-38
    2.2.2 龙牙楤木SS 基因保守序列的克隆  38-39
    2.2.3 龙牙楤木SS 基因3'端序列的PCR 扩增  39-40
    2.2.4 目的片段的回收  40-41
    2.2.5 目的片段与克隆载体连接  41
    2.2.6 制备大肠杆菌DH5α 感受态细胞（CaCl_2法）  41
    2.2.7 重组质粒的转化  41-42
    2.2.8 质粒的提取  42-43
    2.2.9 重组质粒的PCR 鉴定  43
    2.2.10 重组质粒的酶切鉴定  43-44
    2.2.11 测序  44
    2.2.12 龙牙楤木SS 基因全长的PCR 扩增  44
    2.2.13 琼脂糖凝胶回收、与pGM-T 载体的连接和测序  44-45
    2.2.14 生物信息学分析  45
    2.2.15 龙牙楤木SS 基因原核表达载体的构建  45-49
    2.1.16 龙牙楤木 SS 基因的原核表达  49-51
  2.3 结果分析  51-62
    2.3.1 高质量总RNA 的提取  51-52
    2.3.2 双链cDNA 的合成  52
    2.3.3 龙牙楤木SS 基因保守序列的扩增结果  52-53
    2.3.4 测序结果分析  53
    2.3.5 龙牙楤木SS 基因3'端序列的PCR 扩增  53
    2.3.6 龙牙楤木SS 基因3'端序列的回收  53-54
    2.3.7 重组质粒的PCR、酶切鉴定  54
    2.3.8 龙牙楤木SS 基因全长的扩增  54
    2.3.9 龙牙楤木SS 基因的回收、重组质粒的酶切和PCR 鉴定  54-55
    2.3.10 龙牙楤木SS 基因的测序结果分析  55
    2.3.11 生物信息学分析  55-59
    2.3.12 AeSS 基因原核表达载体的构建  59-60
    2.3.13 目的蛋白SDS-PAGE 分析  60-61
    2.3.14 目的蛋白的Western blot 分析  61-62
  2.4 讨论  62-66
第3章 AeSS 在不同器官的表达与三萜皂苷含量测定  66-80
  3.1 材料与仪器  66-68
    3.1.1 植物材料  66
    3.1.2 试剂  66-67
    3.1.3 仪器  67
    3.1.4 试剂及培养基的配置  67-68
  3.2 方法  68-71
    3.2.1 供试样品的制备  68-69
    3.2.2 齐墩果酸的含量测定  69-70
    3.2.3 AeSS 基因在侧根、茎、叶、花中的表达分析  70-71
  3.3 结果分析  71-77
    3.3.1 龙牙楤木愈伤组织的获得  71-73
    3.3.2 不同材料的HPLC 测定  73-75
    3.3.3 Real-time PCR 结果分析  75-77
  3.4 讨论  77-80
第4章龙牙楤木鲨烯合酶基因的真核表达  80-98
  4.1 材料与仪器  80-83
    4.1.1 植物材料  80
    4.1.2 菌株和表达载体  80-81
    4.1.3 试剂  81
    4.1.4 主要试剂的配置  81-83
    4.1.5 主要仪器  83
  4.2 方法  83-92
    4.2.1 龙牙楤木总RNA 的提取  83
    4.2.2 双链cDNA 的合成  83-84
    4.2.3 目的基因的扩增  84
    4.2.4 目的片段的回收、与pGM-T 载体的连接、重组质粒的转化和提取  84
    4.2.5 重组质粒的PCR 鉴定  84-85
    4.2.6 重组质粒的酶切鉴定  85
    4.2.7 测序  85
    4.2.8 龙牙楤木植物表达载体的构建  85
    4.2.9 pBI121-SS 质粒转化农杆菌  85-86
    4.2.10 农杆菌介导SS 基因转化烟草  86-88
    4.2.11 重组酵母表达载体的构建  88-92
  4.3 结果与分析  92-96
    4.3.1 植物表达载体的构建  92
    4.3.2 叶盘转化法  92-93
    4.3.3 转基因烟草的分子检测  93-94
    4.3.4 酵母表达载体的构建  94-95
    4.3.5 酵母转化子的PCR 鉴定  95
    4.3.6 表达产物的SDS-PAGE 分析  95-96
  4.4 讨论  96-98
第5章全文结论  98-100
参考文献  100-113
作者简介及科研成果  113-114
致谢  114

龙牙楤木三萜皂苷生物合成途径中相关基因的研究

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