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链霉菌源次级代谢物的产生、分离和结构鉴定

作　者: 李周
导　师: 赵圣印；唐功利
学　校: 东华大学
专　业: 有机化学
关键词: 天然产物全基因测序生物信息学分析 Borrelidin 萜类化合物
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

链霉菌源的次级代谢物是天然产物药物的重要组成部分,所谓次级代谢是微生物在一定的生长时期(一般是稳定生长期),以初级代谢产物为前体,合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。以初级代谢小分子产物为反应底物,通过一系列特定的酶蛋白催化反应,即多个不同功能的酶依次作用,最终得到微生物次级代谢产物。通过微生物全基因测序和生物信息学分析发现,微生物染色体中有许多小分子化合物的生物合成基因簇,而这些小分子化合物在微生物发酵过程中产量很低或者不产生,通过异源表达的方法可以发酵得到一些结构新奇的小分子化合物或者使化合物产量得到提高,这有利于我们发现更多的新化合物。本课题共分为三个部分：1)链霉菌Streptomyces rochei ATCC10739发酵、次级代谢产物Borrelidin分离纯化和结构确证；2)链霉菌Streptomyces TP-A2060菌株中几个小分子次级代谢产物基因簇的异源表达；3)链霉菌Streptomyces 371菌株中几个小分子次级代谢产物基因簇的异源表达。Borrelidin是从链霉菌(Streptomyces rochei ATCC 10739)中分离到的种18元大环内酯抗生素,其具有CDK(依赖于细胞周期的蛋白激酶)抑制活性和抑制血管生成活性。我们的工作主要是优化发酵条件并对化合物进行分离纯化,对其结构进行确证。在菌株发酵过程中对发酵条件进行优化,以稳定并提高化合物产量。最终确定了最适发酵条件：ISP-2培养基中添加1%甘油,起始pH值为6.0,培养温度30℃,相对湿度50%,发酵时间为7d。化合物经ESI-MS、HR-ESI-MS和1HNMR确证其结构与文献相符。Streptomyces TP-A2060是抗肿瘤抗生素Yatakemycin的产生菌,我们主要是对其中的几个小分子化合物基因进行异源表达。由全基因测序和生物信息学分析可知,化合物主要包括五个萜类化合物、一个芳香族聚酮化合物、一个无法预知结构类型的化合物。通过克隆质粒、异源表达质粒和突变株的构建,我们成功获得了全部基因簇的异源表达质粒、Tep-1和Tep-4的突变株,并对这两个突变株进行了小量发酵。希望通过原生质体转化得到其余突变株,最后发酵得到预期化合物。进一步的突变株构建和发酵工作还在进行中。Streptomyces 371是生物农药金核霉素的产生菌,我们所做的工作主要是希望通过异源表达获得可能的三个萜类化合物和一个芳香族聚酮化合物。目前已经成功得到了全部基因簇的异源表达质粒、Tep-7和Pkz的突变株,质谱结果显示两个突变株小量发酵得到了预期的萜类和聚酮化合物。进一步的研究工作还在进行中。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
缩写和符号  11-12
第一章绪论  12-20
  1.1 通过基因筛库发现新的天然产物  13-15
  1.2 链霉菌的异源表达  15-17
  1.3 本课题的研究背景和研究意义  17-18
  1.4 主要研究内容及所需解决的难点  18-19
  1.5 本课题主要的研究方法和技术路线  19-20
第二章链霉菌Streptomyces rochei ATTC10739发酵、次级代谢产物Borrelidin分离纯化和结构确证  20-30
  2.1 材料与方法  21-23
    2.1.1 菌株  21
    2.1.2 培养基及用途  21-22
    2.1.3 试验仪器  22
    2.1.4 实验方法  22-23
  2.2 娄彻式链霉菌ATTC10739固体发酵条件的优化  23-26
    2.2.1 不同培养基对Borrelidin产量的影响  23-24
    2.2.2 培养时间对Borrelidin产量的影响  24
    2.2.3 起始pH值对Borrelidin产量的影响  24-25
    2.2.4 附加碳源对Borrelidin产量的影响  25
    2.2.5 附加氮源对Borrelidin产量的影响  25-26
  2.3 Borrelidin的分离纯化和结构确证  26-29
    2.3.1 硅胶柱层析纯化  26-27
    2.3.2 半制备HPLC纯化  27-28
    2.3.3 化合物~1HNMR结构确证  28-29
  本章小结  29-30
第三章链霉菌Streptomyces TP-A2060菌株中几个小分子次级代谢产物基因簇的异源表达  30-50
  3.1 材料与方法  32-38
    3.1.1 菌株  33
    3.1.2 质粒  33
    3.1.3 引物  33-34
    3.1.4 仪器  34
    3.1.5 培养基、溶液及试剂  34-35
    3.1.6 实验方法  35-38
  3.2 基因簇的克隆  38-44
  3.3 基因簇表达质粒和突变株的构建  44-46
  3.4 突变株的小量发酵  46-49
  本章小结  49-50
第四章链霉菌Streptomyces 371菌株中几个小分子次级代谢产物基因簇的异源表达  50-68
  4.1 材料与方法  51-54
    4.1.1 菌株  51
    4.1.2 引物  51-52
    4.1.3 培养基、溶液及试剂  52-53
    4.1.4 实验方法  53-54
  4.2 Tep-6基因簇的异源表达  54-56
  4.3 Tep-7基因簇的筛库和异源表达  56-63
  4.4 Tep-8基因簇的异源表达  63
  4.5 Pkz基因簇的异源表达及突变株发酵  63-67
  本章小结  67-68
全文总结  68-70
致谢  70-71
参考文献  71-75
附录  75-76

链霉菌源次级代谢物的产生、分离和结构鉴定

内容摘要

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