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猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查及ORF2区的克隆和表达

作　者: 张厚勇
导　师: 刘正飞
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪戊型肝炎分子流行病学 ORF2基因克隆原核表达
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒引起的,经过粪-口途径传播的新发传染病和人畜共患病。人与猪易感,其中猪是重要的储存宿主和传染源。本研究首先应用HEV ELISA抗体检测试剂盒对湖北地区4个猪场80份血清进行HEV抗体IgG检测,结果显示检测的80份血清中阳性血清56份,抗-HEV抗体阳性率高达70.0%。在此基础上,从2007到2009年,我们从湖北、河南、安徽及湖南四省采集猪临床肝脏样品及肛拭子样品共计583份,根据GenBank中的序列(登录号DQ279091)设计两对引物,应用套式RT-PCR方法检测HEV RNA。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒并测序,利用生物学软件对其遗传进化进行分析。结果表明：从样品分析,HEV总阳率为9.6%(56／583),肝脏样品阳性率为15.55%(21／135,),肛拭子样品阳性率为7.81%(35／448)；从猪场分析,9个猪场中有5个猪场存在HEV,猪场阳性率平均为55.56%(5／9)。将其中具有代表性的两株病毒的PCR产物克隆并提交NCBI,获得了GenBank登录号,其中肝脏样品登录号为：GQ202266,肛拭子样品登录号为：FJ445406。序列分析表明：38株阳性样品之间同源性为92-100%,与戊型肝炎病毒基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分别为77%、77%、87%、96%。遗传进化分析显示,从肛拭子中分离的毒株(FJ445406)与猪源毒株DQ279091处在同一分支上,属于基因4型；肝脏中分离的毒株(GQ202266.1)虽然处在4型分支上,但和4型人源毒株处在一个亚支,属于4型中另一亚型,提示该毒株可能是与人源毒株亲缘关系较近。总体来讲,华中地区猪群中存在HEV,其基因型相对稳定,属同一基因型(4型)。由于戊型肝炎病毒缺乏有效的细胞模型,研究进展相当缓慢。我们在前人研究的基础上,利用A549和IBRS-2、HepG2三种细胞系分别接种HEV的肝脏样品和肛拭子样品,并作3次重复。结果表明：A549和IBRS-2两种细胞系均能增殖HEV病毒,并能稳定传代。其中在A549细胞系中病毒能连续传代21代；IBRS-2细胞系中病毒能连续传代12代以上。用RT-nPCR检测细胞内核酸发现,A549细胞中第一代(前4天)检测不出HEV RNA,但在IBRS-2中却能检测到。以上研究进一步丰富了HEV细胞模型。此外,本研究参照GenBank上登录的人源AJ272108的cDNA序列设计了5对套式RT-PCR引物,分别扩增ORF2、VLP1、VLP2、NE基因。将扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,然后亚克隆至原核表达载体pET-28a,构建原核表达质粒pET-ORF2(1 aa-674 aa)、pET-VLP1 (134 aa-625 aa)、pET-VLP2 (147 aa-540 aa)、pET-NE (407 aa-620 aa)。将表达载体转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,表达蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜和Western blot蛋白印迹分析。结果表明：构建的4个重组质粒中pET-ORF2、pET-VLP1不表达,pET-VLP2和pET-NE在大肠杆菌中获得了高效表达；VLP2和NE表达产物与猪HEV阳性血清发生特异性免疫反应。该研究为研制猪戊型肝炎分子诊断试剂及基因工程疫苗提供了材料。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词(ABBREVIATION)  10-12
第1章文献综述  12-28
  1.1 戊型肝炎病毒的发现  12
  1.2 戊型肝炎的流行病学特点  12-15
  1.3 戊型肝炎的临床特征  15
  1.4 戊型肝炎病毒的分子生物学特性  15-20
    1.4.1 HEV的形态及理化特性  15-16
    1.4.2 HEV的分类  16
    1.4.3 HEV的血清型及基因型  16-17
    1.4.4 HEV的基因组及各基因的功能  17-18
    1.4.5 HEV类病毒颗粒的结构  18-19
    1.4.6 戊型肝炎病毒抗原表位研究进展  19-20
  1.5 HEV的细胞培养  20-21
  1.6 HEV的动物模型  21-23
    1.6.1 非人类灵长类戊肝动物模型  21-22
    1.6.2 家猪动物动物模型  22
    1.6.3 其它动物模型  22-23
  1.7 HEV疫苗的研制  23-24
  1.8 戊型肝炎的诊断方法  24-28
    1.8.1 ELISA  25
    1.8.2 RT-PCR  25-26
    1.8.3 免疫荧光(IFA)  26
    1.8.4 免疫电镜(IEM)  26
    1.8.5 血清中和试验  26-27
    1.8.6 免疫印迹  27
    1.8.7 其他检测方法  27-28
第2章研究的目的和意义  28-29
第3章华中地区猪戊型肝炎(HEV)的分子流行病学调查  29-45
  3.1 试验材料  29-32
    3.1.1 样品的采集与处理  29
    3.1.2 质粒、菌株和细胞系  29
    3.1.3 生化试剂(盒)  29-30
    3.1.4 培养基及溶液的配制  30-32
  3.2 试验方法  32-36
    3.2.1 血清学检测  32-33
    3.2.2 RT-nPCR的检测  33-34
    3.2.3 基因的克隆及序列分析  34-36
    3.2.4 HEV的细胞培养及间接免疫荧光  36
  3.3 试验结果与分析  36-43
    3.3.1 血清学调查结果  36-37
    3.3.2 RT-PCR结果  37-38
    3.3.3 粪便及肛拭子中HEV RNA的检测结果  38-40
    3.3.4 遗传进化分析  40-41
    3.3.5 接毒细胞的HEV RNA的检测及间接免疫荧光结果  41-43
  3.4 讨论  43-45
第4章猪戊型肝病毒ORF2全长基因及截短的ORF2基因在大肠杆菌中的表达  45-66
  4.1 试验材料  45-48
    4.1.1 主要试剂与材料  45-46
    4.1.2 常用的溶液及培养基的配制  46-48
  4.2 试验方法  48-54
    4.2.1 ORF2全长基因及截短的ORF2基因克隆策略  48-49
    4.2.2 基因的克隆  49-52
    4.2.3 表达载体的构建与鉴定  52
    4.2.4 重组蛋白表达与纯化  52-54
  4.3 结果与分析  54-62
    4.3.1 目的基因(ORF2、VLP1、VLP2、NE)的克隆  54-58
    4.3.2 原核表达载体pET-ORF2、pET-VLP1、pET-VLP2、pET-NE的构建及鉴定  58
    4.3.3 SDS-PAGE鉴别不同重组菌的表达  58-61
    4.3.4 Western blot分析  61-62
  4.4 讨论  62-66
结论  66-67
参考文献  67-78
致谢  78-79

猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查及ORF2区的克隆和表达

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