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禽霍乱免疫复合物疫苗的初步研究

作　者: 崔卫涛
导　师: 毕丁仁
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽霍乱 PlpE基因 原核表达 免疫复合物疫苗
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 73次
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内容摘要


禽霍乱(Fowl Cholera)是由禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)引起的主要侵害家禽和野禽的一种急性、接触性传染病。PM菌体外膜蛋白(P1pE)是一种交叉保护因子,对异种血清型菌株的感染能提供一定的保护作用。本研究克隆了PMP1pE基因,并以其表达蛋白为抗原制作免疫复合物疫苗,对其免疫效果进行初步研究,结果如下：1.P1pE基因的克隆与原核表达根据禽多杀性巴氏杆菌ATCC12948株脂蛋白E基因(P1pE)序列设计一对特异性引物,经PCR从禽多杀性巴氏杆菌C48-1株中扩增获得了全长P1pE基因,大小为1011 bp,与已报道的基因核苷酸序列同源性为92%-99%,氨基酸序列同源性为90%-99%。将P1pE片段插入原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-P1pE并在大肠杆菌中进行了高效表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白P1pE约为37.8 kDa,与预期大小相符。Western blot检测结果表明重组蛋白P1pE能与C48-1菌体阳性血清发生特异性反应。用纯化的重组蛋白P1pE免疫小鼠,二免后2 W用10 LD50 C48-1菌株攻毒,免疫小鼠获得了100%保护,表明该蛋白具有良好的免疫原性,为禽霍乱亚单位疫苗研制奠定了基础。2.禽霍乱免疫复合物疫苗的初步研究用大肠杆菌表达的禽多杀性巴氏杆菌重组蛋白P1pE作为抗原,与用该蛋白做抗原免疫鸡制得的血清配制成不同比例的免疫复合物,用白羽肉鸡做动物试验。试验鸡随机分成6组,A、B、C组(抗原抗体比例分别为2：1、4：1、8：1)分别注射3种不同比例的复合物疫苗,D组为只注射蛋白的对照组,E组为生理盐水对照组。各组从免疫后第1W起至第5W,每周采血,用ELISA方法检测抗体效价,第5次采血后用禽多杀性巴氏杆菌C48-1株攻毒。试验结果显示以抗原抗体比例为8：1(C组)免疫后所获得的抗体水平和攻毒保护率较高,近期保护率可达90%,A、B、D、E组分别为80%、60%、70%、0。即C组为抗原抗体比例比较合适的一组。

全文目录


目录  4-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语表  9-10
第1章 文献综述  10-18
  1.1 禽霍乱  10
  1.2 病原  10-11
    1.2.1 形态和染色  10
    1.2.2 菌落形态和相关特性  10-11
    1.2.3 血清型  11
    1.2.4 致病性  11
  1.3 流行病学  11-12
  1.4 临床症状  12
  1.5 病理变化  12
  1.6 禽霍乱的检测方法  12-14
    1.6.1 涂片镜检  12-13
    1.6.2 细菌培养  13
    1.6.3 动物接种试验  13
    1.6.4 ELISA检测抗体  13
    1.6.5 PCR检测  13-14
  1.7 疫苗研究进展  14
    1.7.1 灭活疫苗  14
    1.7.2 弱毒疫苗  14
    1.7.3 亚单位疫苗  14
  1.8 交叉保护因子(CPF)  14-16
    1.8.1 禽多杀性巴氏杆菌的交叉保护现象  14-15
    1.8.2 禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的产生条件  15
    1.8.3 禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的组成成分  15-16
  1.9 免疫复合物疫苗的研究进展  16-18
第2章 禽多杀性巴氏杆菌PLPE基因克隆、表达及免疫活性分析  18-35
  2.1 研究目的和意义  18
  2.2 材料与方法  18-23
    2.2.1 试验材料  18-19
    2.2.2 方法  19-23
  2.3 结果与分析  23-32
    2.3.1 C48-1 PlpE的PCR扩增  23
    2.3.2 重组质粒pMD-PlpE的酶切鉴定  23-24
    2.3.3 PlpE基因的序列测定及结果分析  24-29
    2.3.4 禽霍乱C48-1菌株PlpE基因原核表达载体的构建  29-30
    2.3.5 表达重组PlpE蛋白的检测及免疫原性分析结果  30-32
    2.3.6 小鼠攻毒试验结果  32
  2.4 讨论  32-34
  2.5 结论  34-35
第3章 禽霍乱免疫复合物疫苗的初步研究  35-44
  3.1 研究目的和意义  35
  3.2 材料与方法  35-38
    3.2.1 试验材料  35
    3.2.2 方法  35-38
  3.3 结果与分析  38-42
    3.3.1 鸡抗PlpE蛋白血清效价测定结果  38
    3.3.2 包被抗原和待检血清最佳工作浓度的测定结果  38
    3.3.3 特异性试验结果  38-39
    3.3.4 ELISA检测抗体结果  39-41
    3.3.5 攻毒保护性试验结果  41-42
  3.4 讨论  42-43
  3.5 结论  43-44
参考文献  44-50
致谢  50

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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