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禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因克隆、表达及表达蛋白生物学特性研究
作 者: 王红勋
导 师: 毕丁仁
学 校: 华中农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 多杀巴氏杆菌 禽霍乱 交叉保护因子 PlpB基因
分类号: S852.61
类 型: 硕士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
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禽霍乱(Fowl Cholera)是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，PM)引起的家禽和野禽的一种急性、接触性、败血性传染病。不同血清型的PM所引起的禽霍乱互相之间无交叉保护作用。研究表明，位于PM菌体表面的PlpB蛋白抗原是一种交叉保护因子(Cross Protective Factors，CPF)，对异种血清型菌株的感染能提供一定的保护作用，故该蛋白对开发和研制禽霍乱高效疫苗具有重要意义。本研究针对PMC48-1的PlpB基因的克隆、表达及其表达产物的初步应用开展了以下工作。1．多杀性巴氏杆菌PlpB基因的克隆与高效表达参照GenBank已发表的PM70菌株的PlpB基因序列，设计PMC48-1菌株的PlpB一对寡核苷酸引物。以本实验室保存的C48-1菌株为实验材料，用PCR的方法成功扩增PlpB基因的全序列，该片段共831bp包含一个完整的编码框。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG，成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB，并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定，结果表明：扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99％以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白(命名为ppB)。Western blot检测表明，该表达蛋白具有良好的反应原性。2．多杀巴氏杆菌PlpB表达蛋白免疫保护作用初步研究以表达蛋白ppB乳化后免疫小鼠，连续免疫3次，第一次间隔14d，第二次间隔7d，并用琼脂双向扩散试验检测血清抗体效价。结果，ppB蛋白的抗血清效价达1/16：采免疫小鼠血清注入非免疫小鼠体内，同时进行主动及被动免疫保护试验，结果表明，所构建的原核表达重组质粒pKG-PlpB在大肠杆菌BL21融合表达的蛋白ppB能诱导小鼠产生免疫反应，可保护小鼠抵抗强毒的攻击，这种免疫保护作用也可通过血清被动传递给非免疫小鼠，使后者获得对强毒的抵抗力。本研究是国内首次构建多杀巴氏杆菌PlpB基因的原核克隆载体和表达载体，并将表达产物进行了初步的动物保护试验，为下一步的交叉保护性试验和禽霍乱亚单位疫苗的研制奠定了基础。
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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