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热应激对巴马香猪PBMC TLRs mRNA及TLRs介导的炎症因子表达的影响

作　者: 徐汉进
导　师: 安立龙；巨向红
学　校: 广东海洋大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 热应激 Toll样受体 免疫 细胞因子 PBMC
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 67次
引　用: 2次
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内容摘要


为了探讨热应激诱发动物免疫抑制的可能机理,本研究以巴马香猪为试验材料,应用实时荧光定量PCR、ELISA、放射免疫和细胞培养等技术,系统分析了:(1)巴马香猪TLR2、TLR4基因和蛋白的分子特征;(2)热应激条件下体内和体外PBMC内参基因的表达稳定性;(3)热应激发生不同时段PBMC TLR2、TLR4 mRNA、血浆皮质醇和IL-2、IL-8表达水平;(4)原代培养的PBMC在热打击后不同时段TLR2、TLR4及其选择性剪接体mRNA和IL-12、IFN-γ表达水平的变化。研究结果如下:(1)巴马香猪TLR2基因开放阅读框长2358 bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为7.52,分子量为89.48 kD;与普通猪比对发现巴马香猪TLR2基因有15个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为73.4%、82.4%、59.5%、85.3%、84.6%和82.4%;TLR2膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在21～22位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有4个明显的LRR,分别位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸区;膜外区含6个N连接的糖基化位点。(2)巴马香猪TLR4基因开放阅读框长2526 bp,编码841个氨基酸,该蛋白等电点为6.58,分子量为96.4 kD;与普通猪比对发现巴马香猪TLR4基因有5个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为71.9%、81.5%、54.2 %、86.4 %、85.5%和81.9%;TLR4膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在23～24位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有13个明显的LRR,分别位于第53～74,77～100,101～124,149～173,174～192,201～225,372～393,398～429,446～469,470～494,495～518,519～541,543～566位氨基酸区;膜外区含8个N连接的糖基化位点。(3)通过RT-PCR验证了TLR4-ASV mRNA的存在。并对其可能编码的蛋白生物信息学分析,结果发现:可能的TLR4-ASV蛋白是一种截短的蛋白质,不存在信号肽结构,不属于非经典分泌蛋白,比正常TLR4蛋白少了6个LRR,存在跨膜结构,胞外结构明显缩短。(4)在热应激条件下,GeNorm和NormFinder分析得出的体内PBMC中6种常用的内参基因的稳定性由高到底依次为:ACTB/RPL> B2M >TBP > 18s RNA > GAPDH和B2M+TBP > B2M > TBP > RPL> ACTB> 18s RNA > GAPDH;体外培养的PBMC中5种常用的内参基因的稳定性由高到底依次为:TBP/B2M> ACTB> RPL> GAPDH和TBP+ACTB> ACTB> TBP> RPL> B2M> GAPDH。(5)在体内模型中,对照组巴马香猪PBMC TLR2 mRNA随应激时间延长,总体变化趋势不大,而应激组PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趋势。相同时间点比较发现,除第一天外,应激组TLR2 mRNA水平明显升高(p<0.05)。而应激组TLR4-All mRNA水平在第1、7、14和21天均极显著高于对照组(p<0.01)。对照组血浆皮质醇浓度总体变化不大,而应激组皮质醇浓度随时间延长有上升的趋势。在热应激第7、14和21天应激组皮质醇浓度显著高于对照组(P<0.05)。对照组血浆IL-2水平呈先上升后下降的趋势,总体上变化并不大。而应激组IL-2水平随时间延长有上升趋势。在热应激的第1天、第7天应激组IL-2水平显著低于对照组(P<0.05)。IL-8无论在应激组或对照组都有下降趋势,但同一时间点两者差异不显著(P>0.05)。(6)在体外模型中,对照组巴马香猪PBMC TLR2 mRNA水平总体变化不大,而热应激组PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趋势。在应激后恢复的第3小时,应激组TLR2 mRNA水平显著提高(p<0.05)且达到峰值。在第6、9小时应激组TLR2 mRNA水平有下降趋势。对照组TLR4-All mRNA水平变化不大,而热应激组TLR4-All mRNA水平有先上升后下降的趋势。且在热应激后恢复的第3和第6小时显著提高(p<0.05),第6小时达到高峰。对照组TLR4-ASV mRNA水平总体趋势变化不大,热应激组TLR4-ASV mRNA水平呈现先上升后下降的趋势。在应激后恢复的第3小时应激组TLR4-ASV mRNA水平极显著提高(p<0.001),且在第6和第9小时均显著高于对照组(p<0.05)。对照组血浆IFN-γ水平随着应激时间的延长有降低的趋势,而热应激组IFN-γ水平有先抑制后恢复的趋势。在热应激后恢复的第1小时热应激组IFN-γ水平显著下降(p<0.05),之后逐渐恢复,到第3、6、9小时与对照组相比,差异均不显著(p>0.05)。对照组血浆IL-12水平总体趋势变化不大,热应激组血浆IL-12水平呈现先上升后下降的趋势。在热应激后恢复的第1小时开始应激组血浆IL-12水平开始上升,到第6小时达到高峰且显著高于对照组(p<0.05),之后开始下降,到第9小时与对照组差异不显著(p>0.05)。结论:(1)成功克隆了巴马香猪PBMC TLR2、TLR4以及TLR4-ASV的mRNA。(2)B2M/TBP和ACTB分别是巴马香猪PBMC体内热应激模型和体外热应激模型中最适合的内参基因。(3)热应激上调了巴马香猪PBMC TLR2 mRNA转录水平,上调了TLR4 mRNA、血浆皮质醇和IL-2表达水平,对IL-8没有明显影响。(4)热应激能刺激体外培养的巴马香猪PBMC TLR2、TLR4、TLR4-ASV mRNA及IL-12表达,但对IFN-γ表达则有抑制作用。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-15
第一部分 文献综述  15-42
  第一章 热应激对机体免疫作用的研究进展  17-23
    1 应激的概念和基本特征  17
    2 应激反应的神经内分泌调节  17-21
      2.1 应激反应与糖皮质激素  17-18
      2.2 应激反应与炎症因子  18-19
      2.3 糖皮质激素与免疫调节  19-21
    3 应激与免疫器官变化  21
    4 应激反应与免疫抑制  21-22
    5 急性和慢性应激对动物免疫的影响  22-23
  第二章 细胞TLR 在机体免疫作用中的研究进展  23-34
    1 TLR 的概念  23
    2 TLR 的结构  23-24
    3 TLR 家族  24
    4 TLR 分布  24-27
      4.1 TLR2 分布  24-26
      4.2 TLR4 的分布  26-27
    5 TLR 信号转导  27-28
    6 TLR 缺陷  28
    7 TLR 与免疫的关系  28-33
      7.1 TLR2 与免疫的关系  28-29
      7.2 TLR4 与免疫的关系  29-30
      7.3 TLR 与细胞因子的关系  30-33
    8 小结与展望  33-34
  第三章 热休克蛋白与 TLR 在免疫调节中的相关性  34-37
  第四章 内参基因概念、表达特征及其筛选  37-42
    1 内参基因的概念  37
    2 内参基因的作用  37-38
    3 内参基因使用的的局限性  38-40
      3.1 内参基因的表达易受试验处理及外界刺激的影响  38-39
      3.2 内参基因在不同器官组织表达不同  39
      3.3 内参基因表达受疾病状态的影响  39-40
      3.4 内参基因表达受许多其他因素的影响  40
    4 内参基因的筛选方法  40-41
      4.1 通过geNorm 宏程序筛选内参基因  40-41
      4.2 通过NormFinder 宏程序筛选内参基因  41
      4.3 通过其他的软件程序  41
    5 小结  41-42
第二部分 试验研究  42-100
  第五章 巴马香猪 TLR2、TLR4 及 TLR4-ASV 基因 cDNA 的克隆及生物信息学分析  42-66
    试验一 巴马香猪 TLR2 基因 cDNA 的克隆及生物信息学分析  42-53
      1 材料与方法  43-48
        1.1 试验材料  43
        1.2 试验方法  43-48
      2 结果与分析  48-51
        2.1 RNA 完整性及PCR 产物的特异性分析  48
        2.2 重组质粒PCR 鉴定  48
        2.3 TLR2 基因测序结果及分析  48
        2.4 巴马香猪TLR2 的同源性分析  48-50
        2.5 三维结构预测  50
        2.6 TLR2 信号肽预测  50
        2.7 跨膜结构分析  50
        2.8 保守结构域分析  50-51
        2.9 N-连接的糖基化位点分析  51
      3 讨论  51-52
      4 小结  52-53
    试验二 巴马香猪 TLR4 基因 cDNA 的克隆及生物信息学分析  53-60
      1 材料与方法  54
        1.1 试验材料  54
        1.2 试验方法  54
      2 结果与分析  54-57
        2.1 RNA 完整性及PCR 产物的特异性分析  54-55
        2.2 重组质粒PCR 鉴定  55
        2.3 TLR4 基因测序结果及分析  55
        2.4 巴马香猪TLR4 的同源性分析  55
        2.5 三维结构预测  55-57
        2.6 TLR4 信号肽预测  57
        2.7 跨膜结构分析  57
        2.8 保守结构域分析  57
        2.9 糖基化位点分析  57
      3 讨论  57-59
      4 小结  59-60
    试验三 巴马香猪 TLR4 mRNA 选择性剪接变异体的鉴定及生物信息学分析  60-66
      1 材料与方法  60-62
        1.1 试验材料  60
        1.2 试验方法  60-62
      2 结果与分析  62-63
        2.1 RNA 完整性鉴定及PCR 产物的特异性分析  62
        2.2 TLR4-ASV 氨基酸序列分析  62-63
        2.3 三维结构预测  63
        2.4 TLR4-ASV 信号肽预测  63
        2.5 非经典分泌蛋白预测  63
        2.6 跨膜结构分析  63
        2.7 保守结构域分析  63
      3 讨论  63-65
      4 小结  65-66
  第六章 热应激对巴马香猪 PBMC TLRs mRNA、皮质醇以及 IL-2 和 IL-8 表达水平的影响  66-84
    试验一热应激条件下巴马香猪PBMC 内参基因的筛选  66-73
      1 材料与方法  67-70
        1.1 试验材料  67
        1.2 试验方法  67-70
      2 结果与分析  70-71
        2.1 内参基因扩增效率的评价  70
        2.2 ACTB、GAPDH、TBP、B2M、18sRNA 和 RPL 内参基因的稳定性分析  70-71
      3 讨论  71-72
      4 小结  72-73
    试验二 热应激对巴马香猪体内 PBMC TLRs mRNA、皮质醇、IL-2 和 IL-8 表达水平的影响  73-84
      1 材料与方法  73-74
        1.1 试验材料  73
        1.2 试验方法  73-74
      2 结果与分析  74-78
        2.1 目的基因扩增效率评价  74
        2.2 热应激对PBMC TLR2 及TLR4-All m RNA 转录水平的影响  74-76
        2.3 热应激对血浆皮质醇、IL-2 和IL-8 浓度的影响  76-78
      3 讨论  78-83
        3.1 热应激对巴马香猪PBMC TLR2 m RNA 水平的影响  78-79
        3.2 热应激对巴马香猪PBMC TLR4 m RNA 水平的影响  79-80
        3.3 热应激对巴马香猪血浆皮质醇浓度的影响  80-81
        3.4 热应激对巴马香猪血浆IL-2 浓度的影响  81-83
        3.5 热应激对巴马香猪血浆 IL-8 浓度的影响  83
      4 小结  83-84
  第七章 热应激对体外培养的巴马香猪 PBMC TLRs mRNA、IL-12 和IFN-γ 表达水平的影响  84-99
    试验一 热打击条件下体外培养的巴马香猪PBMC 内参基因筛选  84-88
      1 材料与方法  84-85
        1.1 材料  84-85
        1.2 试验方法  85
      2 结果与分析  85-86
      3 讨论  86-87
      4 小结  87-88
    试验二 热打击对体外培养的巴马香猪 PBMC TLRs mRNA、IL-12 和 IFN-γ 表达水平的影响  88-99
      1 材料与方法  88-89
        1.1 材料  88
        1.2 试验方法  88-89
      2 结果与分析  89-93
        2.1 热应激对体外培养的PBMC TLR2、TLR4-All 及TLR4 ASV m RNA 转录水平的影响  89-91
        2.2 热应激对体外培养的PBMC 培养液上清IL-12 和IFN-γ表达水平的影响  91-93
      3 讨论  93-98
        3.1 热应激对体外培养的PBMC TLR2 m RNA 转录水平的影响  93-94
        3.2 热应激对体外培养的PBMC TLR4-All mRNA 转录水平的影响  94-96
        3.3 热应激对体外培养的PBMC TLR4-ASV m RNA 转录水平的影响  96
        3.4 热应激对体外培养的PBMC IFN-γ表达水平的影响  96-97
        3.5 热应激对体外培养的PBMC IL-12 表达水平的影响  97-98
      4 小结  98-99
  第八章 总论  99-100
参考文献  100-114
致谢  114-115
作者简介  115-116
导师简介  116-118
附录有关图片及其说明  118-121

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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