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苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定

作　者: 谢宇飞
导　师: 黄志鹏
学　校: 福建农林大学
专　业: 农药学
关键词: 苏云金芽孢杆菌几丁质酶 chi36基因酶学性质
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)010菌株总DNA为模板,通过PCR方法扩增几丁质酶 chi36基因,将PCR回收产物与pMD18-T载体连接,构建克隆重组菌pMD-chi36,经核苷酸及氨基酸序列分析,chi36基因ORF 1083 bp,编码360个氨基酸,预测其蛋白分子量约为39.0 kDa,等电点为6.52。通过在线软件分析比对表明其核苷酸序列与Bt 15A3、Bc CH、Bc 28-9以及Bc 6E1的几丁质酶基因同源性分别为97%、99%、99%、93%。在线ScanProsite软件分析表明该几丁质酶属于18家族几丁质酶,在线软件推导出其属于一种胞外酶,蛋白质一级结构只含有几丁质酶催化区,缺少粘蛋白Ⅲ型同源区(fibronectin-like domains,FLDs)和几丁质结合区(chitin-binding domain,CBD)。将pMD-chi36与pGEX-KG表达载体连接,构建重组表达载体pGEX-chi36,并成功转入大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)。SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白为65 kDa左右,其中包含26 kDa GST标签。提取pGEX-chi36的粗酶液,研究表明该酶对几丁质平板有降解作用。用DNS方法测定酶的活性,最适作用温度55℃,酶活为488.21 U?mL ,最适pH值5.0,酶活为170.43 U?mL。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
引言  9-18
  1 苏云金芽孢杆菌  9
  2 几丁质酶  9-15
    2.1 几丁质酶概述  9
    2.2 几丁质酶分类  9-10
    2.3 几丁质酶来源  10-15
      2.3.1 植物几丁质酶  10-11
      2.3.2 动物几丁质酶  11-13
      2.3.3 微生物几丁质酶  13-15
        2.3.3.1 微生物几丁质酶理化性质  13
        2.3.3.2 微生物几丁质酶氨基酸序列  13-14
        2.3.3.3 微生物几丁质酶应用  14-15
  3 Bt chi36 基因分子生物学研究  15-17
  4 本研究的目的及意义  17-18
材料与方法  18-30
  1 材料  18-20
    1.1 菌株  18
    1.2 培养基  18
    1.3 试剂盒  18
    1.4 酶类  18
    1.5 其他试剂  18-20
  2 方法  20-30
    2.1 总DNA 的提取  20
    2.2 Bt 几丁质酶基因克隆  20-25
      2.2.1 几丁质酶基因引物设计  20-21
      2.2.2 PCR 反应体系  21
      2.2.3 PCR 循环条件  21
      2.2.4 PCR 产物回收  21-22
      2.2.5 连接反应  22
      2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  22
      2.2.7 转化和筛选  22-23
      2.2.8 提取重组质粒pMD-chi36  23
      2.2.9 重组质粒PCR 鉴定  23-24
      2.2.10 重组质粒酶切鉴定  24-25
      2.2.11 基因片段测序  25
    2.3 几丁质酶蛋白的原核表达  25-28
      2.3.1 表达菌的构建  25-27
        2.3.1.1 质粒的提取  25
        2.3.1.2 质粒双酶切  25
        2.3.1.3 琼脂糖凝胶中酶切产物回收  25-26
        2.3.1.4 酶切回收产物连接  26
        2.3.1.5 大肠杆菌感受态的制备  26
        2.3.1.6 转化和筛选  26
        2.3.1.7 重组质粒DNA 的提取  26
        2.3.1.8 重组质粒的PCR 鉴定  26
        2.3.1.9 重组质粒的酶切验证  26-27
      2.3.2 目的蛋白的诱导表达  27-28
        2.3.2.1 IPTG 诱导  27
        2.3.2.2 样品的制备  27
        2.3.2.3 SDS-PAGE  27-28
    2.4 胶体几丁质平板降解  28
    2.5 几丁质酶酶活测定  28-30
      2.5.1 温度对酶活的影响  28
      2.5.2 pH 对酶活的影响  28-30
结果与分析  30-41
  1 几丁质酶基因的克隆及序列分析  30-37
    1.1 PCR 扩增及重组质粒酶切验证  30-31
    1.2 序列分析  31-37
      1.2.1 核苷酸序列同源性分析  31-32
      1.2.2 氨基酸序列分析  32-35
      1.2.3 蛋白质功能区的预测  35
      1.2.4 跨膜信号分析  35-37
  2 原核表达  37-39
    2.1 原核表达菌的构建  37-39
    2.2 目的蛋白诱导表达  39
  3 胶体几丁质降解  39-40
  4 几丁质酶酶活测定  40-41
    4.1 温度对酶活的影响  40-41
    4.2 pH 对酶活的影响  41
小结与讨论  41-43
  1 表达载体的选择  42
  2 融合蛋白的纯化  42
  3 展望  42-43
参考文献  43-50
致谢  50

苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定

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