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兔粪堆肥控制参数研究及其微生物群落变化的PCR-DGGE分析

作　者: 岳铁军
导　师: 白林
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 高温堆肥兔粪菌渣理化参数细菌群落 16S rDNA PCR-DGGE
分类号: S141.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本试验采用主动通风方式,以兔粪和菌渣为原料进行室内高温堆肥试验。设置了2个试验组和2个纯兔粪对照组,在为期51d的堆肥过程中,研究了堆体温度、含水率、pH、总有机碳、总氮、总磷、总钾、种子发芽指数、细菌群落总数和大肠杆菌菌群数的变化规律及其影响因素。利用PCR-DGGE分子生物学方法研究了在堆肥高温发酵过程中微生物群落结构动态及其变化规律,并分析了微生物群落结构演替与理化指标之间的关系,从而进一步了解兔粪高温发酵的作用机制。旨在为兔粪高温堆肥过程中的辅料选择、配方确定以及控制各种影响因素等提供科学依据,从而探索一种兔粪无害化、减量化和资源化利用的高效实用的堆肥方法,为规模化兔场兔粪堆肥处理提供技术储备。试验结果表明：1、兔粪高温堆肥生产中,利用兔粪和菌渣按2.6：1混合,初始水分控制在55%-60%,进行堆肥能正常发酵,且能达到无害化处理的目的,在生产中可以此为参考对兔粪进行堆肥生产有机肥料。2、在整个堆制过程中,兔粪菌渣混合堆肥和纯兔粪堆肥的TOC相对含量和C／N持续下降,TN相对含量则持续升高,TP、TK的绝对含量基本不变,这与其他畜禽粪便堆肥规律相似。细菌总数整体呈下降趋势,纯兔粪组下降趋势不明显；大肠杆菌在堆肥高温期大部分死亡,在腐熟阶段少量苏醒繁殖。3、整个堆肥过程中,试验组和对照组的pH分别为8.70和8.73；C／N分别为22.53和17.86；随着堆肥化的进行抑制种子发芽的物质被慢慢消除,在37天以后种子发芽指数全部达到0.8以上,以上各指标均基本符合国家堆肥腐熟的标准。4、利用PCR-DGGE技术对堆肥微生物的群落结构进行了研究,发现堆肥过程中微生物群落结构的演替比较清楚。DGGE指纹图谱显示堆肥细菌的变化规律：“升高-降低-平稳”,在高温阶段有比较丰富的优势细菌群落。5、在整个堆制期间,DGGE指纹图谱多样性与传统培养细菌结果并不十分吻合；对照组的细菌多样性指数平均为1.82,略高于试验组1.74,表明,对照组中细菌群落数多于试验组,但其优势菌群不如试验组明显；堆体中微生物主要来源于兔粪中的土著微生物,所以二者的DGGE条带相似度在50%以上；兔粪高温堆肥中细菌多样性与堆体温度变化趋势相似而与C／N比变化趋相反。6、试验中对照组除pH值变化与试验组差异较大外,其它参数变化均与试验组趋于一致。50℃以上的高温期能持续9天,大肠杆菌和GI值也符合堆肥腐熟的要求,TN、TP水平略高于试验组。说明生产中如调节好初始水分,采用被动通风堆肥方式,即可以利用兔粪不加辅料进行堆肥,这样可以使兔粪堆肥更加简单,成本更低。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
常用词语英文缩写  9-13
前言  13
1 文献综述  13-22
  1.1 畜禽粪便的排放情况和污染危害  13-15
    1.1.1 畜禽粪便的排放情况  13-14
    1.1.2 畜禽粪便对环境的污染危害  14-15
  1.2 畜禽粪便堆肥化处理  15
  1.3 利用兔粪进行堆肥的意义  15
  1.4 畜禽粪便堆肥的技术原理  15-17
    1.4.1 堆肥化概念  15-16
    1.4.2 堆肥过程的影响因素  16-17
    1.4.3 堆肥中的微生物多样性  17
  1.5 变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物中的应用  17-21
    1.5.1 变性梯度凝胶电泳原理及技术流程  18-19
    1.5.2 DGGE技术在堆肥微生物中的应用  19-20
    1.5.3 DGGE技术存在的缺陷及对策  20-21
  1.6 本研究的主要内容和目的意义  21-22
2 材料与方法  22-37
  2.1 试验材料  22-27
    2.1.1 试验原料和场地  22
    2.1.2 主要试剂  22
    2.1.3 主要仪器设备  22-23
    2.1.4 主要试剂及配制  23-27
  2.2 试验方法  27-29
    2.2.1 试验分组  27-28
    2.2.2 物料配比  28
    2.2.3 堆肥工艺设计  28
    2.2.4 样品的采集、处理与保存  28-29
  2.3 测定项目及方法  29-30
    2.3.1 理化指标测定  29
    2.3.2 微生物学指标测定  29-30
    2.3.3 植物毒理学指标测定  30
  2.4 PCR-DGGE试验方法  30-36
    2.4.1 分子生化样品预处理  30-31
    2.4.2 堆肥微生物总DNA提取及检测  31-32
    2.4.3 引物合成  32
    2.4.4 PCR扩增  32-33
    2.4.5 DGGE分析  33-36
  2.5 数据统计与分析  36-37
3 结果分析  37-52
  3.1 堆料物理化学指标检测结果分析  37-45
    3.1.1 温度  37
    3.1.2 水分  37-38
    3.1.3 pH变化  38-39
    3.1.4 TOC变化  39-40
    3.1.5 TN变化  40-41
    3.1.6 C/N变化  41-42
    3.1.7 TP、TK变化  42-43
    3.1.8 细菌总数变化  43
    3.1.9 大肠杆菌变化  43-44
    3.1.10 种子发芽指数(GI)变化  44-45
  3.2 PCR-DGGE技术分析堆肥细菌群落变化  45-50
    3.2.1 堆肥样品微生物基因组DNA提取结果  45-46
    3.2.2 堆肥细菌DNA扩增产物检测  46-47
    3.2.3 DGGE检测结果  47-50
  3.3 堆肥理化指标与微生物分子生物学检测结果综合分析  50-52
    3.3.1 DGGE指纹图谱与C/N的关系  50-51
    3.3.2 DGGE指纹图谱与可培养细菌总数的关系  51-52
4 讨论  52-59
  4.1 堆肥效果总体评价  52
  4.2 温度的变化  52
  4.3 含水率的变化  52-53
  4.4 pH的变化  53
  4.5 有机碳、总氮、C/N的变化  53-54
  4.6 TP、TK的变化  54-55
  4.7 细菌总数和大肠杆菌总数的变化  55-56
  4.8 种子发芽率的变化  56
  4.9 DGGE指纹图谱分析细菌群落的变化  56-57
  4.10 影响本试验微生物分子生物检测的因素  57-58
    4.10.1 堆肥总DNA的提取  57
    4.10.2 影响PCR扩增和检测的因素  57-58
    4.10.3 DGGE图谱分析  58
  4.11 兔粪对照组堆肥效果  58-59
5 结论  59-60
6 展望  60-61
参考文献  61-68
致谢  68-69
附录:硕士研究生学习期间参与科研项目及发表文章  69

兔粪堆肥控制参数研究及其微生物群落变化的PCR-DGGE分析

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