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转基因香石竹遗传稳定性及其对土壤微生物群落影响初探
作 者: 白蓝
导 师: 赵明文;潘爱虎
学 校: 南京农业大学
专 业: 微生物学
关键词: 转基因香石竹 遗传稳定性 土壤微生物 群落结构 16S rDNA
分类号: S682.19
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
香石竹是一种重要的观赏类园艺植物。为提高其观赏价值,澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司通过转基因方法,将二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavono 1-4-Reductase, DFR)基因和类黄酮-3’,5’-羟化酶(flavonoid-3’,5’-Hydroxylase, F3’5’H)基因导入到白色香石竹FE123中,获得了花色呈蓝紫色的转基因香石竹,月之霓裳"Moonshade"和月之伊人"Moonlite"是其中两个品系。由于转基因植物的环境释放可能存在着潜在的生物安全风险,因此对转基因植物的环境安全评估十分必要。转基因植物中外源基因的遗传稳定性,以及转基因植物对土壤微生物群落结构可能存在的影响是评估转基因植物环境安全性的重要组成部分。作为在中国进行环境安全评价中间试验的第一例转基因花卉,本文对转基因香石竹中的外源基因F3’5’H的遗传稳定性,以及转基因香石竹的栽培对土壤微生物群落结构的影响这两方面进行了初步探讨。针对杂交矮牵牛中的F3’5’H全长基因设计了一对引物,经克隆获得转基因香石竹中的F3’5H全长基因约1.5 kb。经序列比对,获得的F3’5’H序列与已报道的杂交矮牵牛中的F3’5’H序列同源性为100%。构建了该基因的原核表达载体,获得了工程菌株E. coli BL21(DE3) (+F3’5’H),经诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示,该菌株高效表达出F3’5’H重组蛋白,约占菌体总蛋白的30%。用经纯化的F3’5’H重组蛋白作为抗原制备抗血清,经ELISA免疫学分析表明,该抗血清的滴度为1:25600. Western blot结果表明F3’5’H重组蛋白具有良好的IgG结合活性,且抗血清与转基因香石竹品系Moonshade和Moonlite中的外源基因F3’5’H所表达的蛋白发生明显的抗原抗体反应。采用菌落计数法对转基因与非转基因香石竹植株的根系土壤微生物进行了数量分析,结果表明转基因香石竹与非转基因香石竹根系土壤中2大类微生物(细菌和真菌)的数量存在一些差异,但经统计学分析表明差异不显著,说明转基因香石竹尚未对土壤微生物的数量造成显著影响。比较了试验室手提法和试剂盒法提取土壤基因组DNA的效果。结果表明,手提法所得DNA量要高于试剂盒法,但是纯度不及试剂盒法,且耗时长,步骤繁琐。因此最终采用试剂盒法完成后续试验。通过16S rDNA克隆文库分析方法,比较了转基因香石竹和非转基因香石竹土壤细菌的群落结构组成,发现所构建的文库的细菌多样性十分丰富,存在8个主要类群,其中转基因香石竹和非转基因香石竹土壤共有的优势菌群有α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)。在转基因香石竹土壤中得到少量的疣微菌门(Verrucomicrobia)相似株,其余3个菌群在转基因和非转基因香石竹土壤中都有分布。总体来说,转基因香石竹和非转基因香石竹的土壤细菌群落结构没有显著差异,转基因香石竹的栽培未对土壤细菌群落结构造成显著影响。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11名词缩写 11-12第一章 文献综述 12-20 1 香石竹概况 12-14 1.1 蓝色香石竹的由来 12-13 1.2 类黄酮-3',5'-羟化酶在花色素苷合成途径中的位置 13 1.3 类黄酮-3',5'-羟化酶基因的研究进展 13-14 2 转基因植物的生物安全评价 14-15 3 土壤微生物生态学研究进展 15-17 3.1 克隆文库分析法的原理 15-16 3.2 细菌16S rDNA克隆文库法 16 3.3 细菌16S rDNA克隆文库法的应用 16-17 3.4 细菌16S rDNA克隆文库法中的存在的问题及应对 17 3.5 其他的微生物生态学方法 17 4 本文选题依据 17-20第二章 转基因香石竹F3'5'H基因的遗传稳定性研究 20-36 第一节 转基因香石竹中F3'5'H基因的克隆 21-26 1 实验材料 21 1.1 植株和菌株 21 1.2 试剂 21 1.3 培养基与缓冲液 21 2 实验方法 21-23 2.1 香石竹基因组DNA的提取(试剂盒法) 21-22 2.2 引物设计 22 2.3 类黄酮-3',5'-羟化酶全长基因的PCR扩增 22-23 2.4 类黄酮-3',5'-羟化酶全长基因的克隆 23 3 结果与讨论 23-26 第二节 转基因香石竹中F3'5'H基因的原核表达 26-31 1 实验材料 26 1.1 菌种 26 1.2 试剂 26 2 实验方法 26-30 2.1 F3'5'H全长基因和pET-28a质粒的获得 26 2.2 F3'5'H全长基因和pET-28a的质粒酶切 26-27 2.3 片段与质粒的连接 27 2.4 连接产物的转化及表达菌株的构建 27-28 2.5 F3'5'H重组蛋白的诱导表达 28-29 2.6 F3'5'H重组蛋白的纯化 29 2.7 F3'5'H重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 29-30 3 结果与讨论 30-31 第三节 转基因香石竹中F3'5'H基因的多克隆抗体的制备及免疫学鉴定 31-36 1 实验材料 31 1.1 实验用动物 31 1.2 试剂 31 2 实验方法 31-33 2.1 多克隆抗体的制备 31 2.2 ELISA检测 31-32 2.3 Moonshade和Moonlite花朵总蛋白的提取 32 2.4 Western Blot检测 32-33 3 结果与讨论 33-36 3.1 ELISA检测 33 3.2 Western blot检测 33-36第三章 转基因香石竹对土壤微生物群落结构的影响 36-58 第一节 土壤微生物的纯培养试验 37-40 1 实验材料 37 1.1 土壤样品 37 1.2 试剂及培养基配方 37 2 实验方法 37-38 2.1 土壤溶液的制备 37 2.2 培养 37 2.3 结果统计与分析 37-38 3 结果与讨论 38-40 第二节 土壤微生物的总DNA的提取 40-44 1 实验材料 40 1.1 土壤样品 40 1.2 试剂 40 2 实验方法 40-41 2.1 实验室手提法 40-41 2.2 试剂盒法 41 2.3 数据处理 41 2.4 电泳 41 3 结果与讨论 41-44 第三节 16S rDNA克隆文库分析 44-58 1 试验材料 44 1.1 土壤DNA 44 1.2 试剂及培养基 44 2 试验方法 44-48 2.1 16S rDNA区扩增 44-45 2.2 16S rDNA目的片段的回收纯化 45 2.3 16S rDNA克隆文库的建立 45-47 2.4 酶切分型(ARDRA)分析 47-48 3 结果与讨论 48-58 3.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 48-49 3.2 细菌16S rDNA的克隆文库分析 49-58全文总结 58-60参考文献 60-68附录 培养基及试剂配方 68-74发表论文及专利 74-76致谢 76
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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺(花卉和观赏树木) > 多年生花卉类 > 宿根花卉类 > 其他
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