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苯磺隆、使它隆降解菌的分离鉴定及生长特性的初步研究

作　者: 田方方
导　师: 王晓萍
学　校: 哈尔滨师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 苯磺隆使它隆生理生化降解菌 16S rDNA
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

我国是农业大国,调整种植结构、提高单位面积粮食产量和品质己成为当前农业生产的首要任务。随着农业生产技术水平的不断提高,除草剂己被广泛应用于农业生产当中,苯磺隆(Tribenuron-methyl)、使它隆(Fluroxypyr)是麦田常用的两种除草剂,由于其高效、快速、广谱、对作物安全、使用方便的特点而得到大面积推广使用。随着它们的大量应用暴露出了很多问题。农业耕作过程中所施用的除草剂仅有少部分被植物吸收,大部分残留在土壤中,对农业生态系统造成污染,进而影响人类健康,引起了人们的高度重视。因此,研究其污染的治理具有重要意义。本文研究采用传统富集培养方法从多年施用苯磺隆、使它隆的麦田采集土样,分离筛选出一批对两种农药有降解作用的细菌菌株,它们能以除草剂为唯一碳源生长。4株苯磺隆降解菌分别命名为B1、B2、B3和B4;3株使它隆降解菌分别命名为S1、S2和S3。通过形态学观察、生理生化测试和16S rDNA序列分析,B1鉴定为铜绿假单胞菌属(P. aeruginosa),B2和S1为戴尔福特菌属( Delftia sp. ),B3为微杆菌属( Microbacterium sp. ),B4为产碱菌属(Alcaligenes sp.)S2和S3沙雷氏菌属(Serratia sp.),其中S2被鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。7株降解菌在pH6~pH9的范围内均可生长,菌株B3在pH8.0时生长最佳,菌株B1、B2、B4、S1、S2和S3以在pH7.0时生长最佳;在20℃~40℃的温度范围内均可生长,菌株B1最适温度为35℃,另六株菌最佳生长温度是30℃;除草剂浓度对菌株生长具有一定的影响,菌株B3和S2最适生长浓度为100mg/L,菌株B1、B2、B4、S1、和S3最适浓度均为200mg/L;装液量为25ml~150ml(250ml三角瓶)均可生长,通气量为3/10体积时菌株B1、B2、B3、B4和S1生长状况最好,而S2和S3则为2/5;接菌量在5%~20%菌株均可生长,菌株B2、B4、S1、S2和S3最适接菌量为10%,菌株B1和B3则为15%;在硝酸钠、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵四种外加氮源中,硝酸铵对降解菌株生长最有利;葡萄糖、蔗糖与乳糖三种外加碳源,葡萄糖对降解菌株生长的促进作用更好;Mg2+浓度为50 mg/L~300 mg/L的范围内,菌株均可生长,以Mg2+浓度为100 mg/L时菌株B2和S1的生长最佳,菌株B1、B3、B4、S2和S3则以Mg2+浓度为100 mg/L为最适添加浓度;7株降解菌有不同的耐盐性,NaCl浓度为20g/L为菌株B1、B2最适盐度,菌株B2在5g/L~30g/L范围内生长量基本一致,菌株S1、S2和S3最适盐度则出现在30g/L,浓度提高到150g/L之后各菌株生长均受到明显抑制。七株降解菌均具有良好的抗性。菌株B1对卡那霉素、氯霉素有抗性,菌株B2对四环素有抗性,菌株B3对氨苄青霉素、庆大霉素、红霉素有抗性,菌株B4在所有抗生素中均能生长,菌株S1对四环素有抗性,菌株S2对卡那霉素、链霉素有抗性,菌株S3对链霉素、氯霉素有抗性。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第1章绪论  11-21
  1.1 除草剂要害  11-12
  1.2 除草剂的微生物降解  12-15
    1.2.1 微生物降解除草剂的机理  12-13
    1.2.2 影响除草剂微生物降解的因素  13-15
  1.3 除草剂苯磺隆、使它隆的概述  15-20
    1.3.1 苯磺隆概述  15-17
    1.3.2 使它隆概述  17-20
  1.4 课题研究的提出与意义  20-21
第2章苯磺隆、使它隆降解菌的分离筛选与鉴定  21-53
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 样品来源  21
    2.1.2 主要仪器及设备  21
    2.1.3 实验试剂及培养基成分  21-22
  2.2 实验方法  22-38
    2.2.1 土壤样品的采集  22
    2.2.2 苯磺隆、使它隆降解菌的富集与分离纯化  22-23
    2.2.3 细菌的形态学观察与生理生化鉴别[116~120]  23-33
    2.2.4 细菌的DNA 鉴定  33-37
    2.2.5 菌种保藏  37-38
  2.3 结果与分析  38-51
    2.3.1 降解菌株的筛选  38
    2.3.2 降解菌的形态观察与生理生化实验结果  38-41
    2.3.3 基因组DNA 的提取及PCR 扩增  41-42
    2.3.4 16S rDNA 测序结果分析  42-51
  2.4 讨论  51-52
    2.4.1 提高PCR 产物回收量的方法  51
    2.4.2 菌落PCR 过程中的假阳性问题  51-52
  2.5 本章小结  52-53
第3章苯磺隆、使它隆降解菌生长特性的初步研究  53-72
  3.1 引言  53
  3.2 实验材料与试剂  53-54
    3.2.1 实验仪器  53
    3.2.2 实验材料  53
    3.2.3 培养基成分  53
    3.2.4 药品与试剂  53-54
  3.3 实验方法  54-56
    3.3.1 菌悬液的制备  54
    3.3.2 菌株生长曲线的绘制  54
    3.3.3 培养基初始pH 值对菌株生长的影响  54
    3.3.4 培养温度对菌株生长的影响  54
    3.3.5 除草剂初始浓度对菌株生长的影响  54
    3.3.6 培养基体积（通气量）的影响  54-55
    3.3.7 接菌量对菌株生长的影响  55
    3.3.8 不同氮源对菌株生长的影响  55
    3.3.9 外加碳源对菌株生长的影响  55
    3.3.10 Mg~(2+)浓度对菌株生长的影响  55
    3.3.11 盐度对菌株生长的影响  55
    3.3.12 耐药性检测  55-56
  3.4 结果与分析  56-70
    3.4.1 生长曲线的绘制  56-57
    3.4.2 培养基初始pH 值的影响  57-58
    3.4.3 培养温度的影响  58-60
    3.4.4 除草剂初始浓度的影响  60-61
    3.4.5 通气量的影响  61-62
    3.4.6 接种量对菌株的影响  62-63
    3.4.7 加入不同氮源的影响  63-65
    3.4.8 不同外加碳源的影响  65-66
    3.4.9 Mg~(2+)离子浓度的影响  66-67
    3.4.10 不同NaCl 浓度对菌株的影响  67-69
    3.4.11 抗生素抗性实验结果  69-70
  3.5 实验结论  70-71
  3.6 本章小结  71-72
结论  72-73
参考文献  73-82
附录  82-87
攻读硕士期间发表的学术论文  87-88
致谢  88

苯磺隆、使它隆降解菌的分离鉴定及生长特性的初步研究

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