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新型抗真菌抗生素发酵工艺和分离纯化的研究

作　者: 张书衍
导　师: 陈小龙；张朝晖
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 抗真菌抗生素 16S rDNA 响应面优化 发酵动力学模型
分类号: TQ927
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


近年来,随着深部真菌感染疾病的感染率逐渐提高,对患者的健康和生命造成了很大的威胁。课题组筛选得到一株芽孢杆菌,能产生大环内酯类抗真菌抗生素,对主要引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。该芽孢杆菌经16S rDNA序列测定和NCBI数据库BLAST搜索,确定其与Bacillus subtilis strain BRZ6的16S rDNA序列同源性为93%。本论文首先采用单因素优化方法对该抗生素的摇瓶培养工艺进行了优化,确定了最佳发酵培养基组成（g/L）为:可溶性淀粉浓度40,黄豆饼粉8.25, （NH4）2SO4 13.75,K2HPO4 2.4, NaCl 2, MgSO4 0.5, CaCO3 0.72, CuSO4 0.02, FeSO4 0.02, MnSO4 0.02;最佳发酵条件为:pH 6.5,接种量8%,转速200 rpm,装液量40 mL/250 mL,28℃下摇瓶发酵36 h产抗水平最高达到7026.788 U/mL,效价提高了3.49倍。采用响应面法优化该抗生素的摇瓶培养工艺,通过Plackett-Burman试验发现影响抗生素抗真菌效价的3个主要因素为:黄豆饼粉,可溶性淀粉以及（NH4）2SO4。采用最陡爬坡试验和Box-Behnken试验设计得到的响应面优化（RSM）后的最佳培养基（g/L）为:黄豆饼粉2.72,可溶性淀粉26.67,（NH4）2SO4 3.95,K2HPO4 2.4, NaCl 2, MgSO4 0.5, CaCO3 0.72, CuSO4 0.02, FeSO4 0.02, MnSO4 0.02。采用上述优化培养基,抗生素效价由最初的7026.788 U/mL提高到16806.48 U/mL,提高了2.39倍。在摇瓶工艺优化基础上,进一步进行了5 L通气搅拌罐产抗的放大试验。采用RSM法优化得到的发酵培养条件下,在搅拌转速200 rpm、通气量200L/h、装液量60%（v/v）、接种量10%（v/v）条件下进行36小时的发酵,效价达到7137.45 U/mL.选用单因素法优化得到最佳发酵条件:搅拌转速500 rpm,通气量500L/h,发酵液初始pH值6.5,装液量60% （v/v）,接种量10% （v/v）,发酵时间28 h。发酵液抗生素效价为摇瓶发酵的1.2倍。在此基础上,采用Logistic增殖模型建立了细胞增长和抗生素形成的动力学模型,并采用Origin8.0软件拟合获得了模型参数。验证试验表明,模型基本反映了该芽孢杆菌分批发酵生产抗真菌抗生素的动力学特征。最后,对抗真菌物质的结构进行鉴定,发现其为Macrolactin家族结构类似物。该物质对黑曲霉、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等有较强的抑制作用,并且对人体病源真菌白色念珠菌有良好的抑制作用,抗菌谱广,具有较好的新药开发前景。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
第一章 文献综述  13-21
  1.1 引言  13-14
  1.2 抗真菌抗生素的介绍  14-15
  1.3 抗真菌抗生素的抗菌机理及发展方向  15-17
  1.4 抗真菌抗生素的药物种类  17
  1.5 抗真菌抗生素的应用现  17-20
  1.6 研究内容及思路  20-21
第二章 菌种的鉴定  21-30
  2.1 引言  21-22
  2.2 材料与方法  22-26
    2.2.1 实验材料  22-23
    2.2.2 仪器  23
    2.2.3 培养基  23
    2.2.4 菌种培养方法  23
    2.2.5 改进的CTAB 法提取细菌基因组DNA  23-24
    2.2.6 电泳检测(0.8%琼脂糖凝胶，20 mL)  24
    2.2.7 PCR 扩增反应体系20 μL  24-25
    2.2.8 T 载体连接体系（10 μL）  25
    2.2.9 转化  25
    2.2.10 挑选阳性克隆子并进行菌落PCR  25-26
    2.2.11 质粒DNA 提取  26
    2.2.12 测序及进化树的建立  26
  2.3 结果与讨论  26-29
  2.4 小结  29-30
第三章 单因素优化摇瓶发酵条件  30-46
  3.1 引言  30
  3.2 材料与方法  30-35
    3.2.1 实验材料  30-32
    3.2.2 实验方法  32
    3.2.3 分析方法  32-35
  3.3 结果与讨论  35-45
    3.3.1 葡萄糖标准曲线  35-36
    3.3.2 制霉菌素标准曲线  36
    3.3.3 发酵培养条件的优化  36-41
    3.3.4 发酵培养基组成的优化  41-45
  3.4 小结  45-46
第四章 响应面优化发酵培养基  46-55
  4.1 引言  46
  4.2 材料与方法  46-47
    4.2.1 材料  46
    4.2.2 方法  46-47
  4.3 结果与讨论  47-54
    4.3.1 Plackett-Burman 设计法筛选培养基成分中的重要因子  47-49
    4.3.2 最陡爬坡实验设计  49-50
    4.3.3 响应面分析方法确定重要因子的最适浓度  50-54
  4.4 小结  54-55
第五章 发酵工艺放大及动力学研究  55-69
  5.1 引言  55
  5.2 材料与方法  55-57
  5.3 结果与讨论  57-67
    5.3.1 发酵条件的优化  57-59
    5.3.2 核酸与菌体干重的关系  59-60
    5.3.3 发酵过程中动力学研究  60-67
  5.4 小结  67-69
第六章 抗生素的分离纯化和结构预测  69-77
  6.1 引言  69
  6.2 材料与方法  69-71
    6.2.1 实验材料  69-70
    6.2.2 实验方法  70-71
  6.3 结果与讨论  71-76
    6.3.1 抗生素的HPLC 分析  71-72
    6.3.2 抗真菌抗生素结构的初步分析  72-74
    6.3.3 抗真菌抗生素抗菌活性检测  74-76
  6.4 小结  76-77
第七章 结论与建议  77-79
  7.1 结论  77-78
  7.2 建议  78-79
参考文献  79-83
致谢  83-84

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制抗菌素
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