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大连海域可培养海洋放线菌的分离筛选及鉴定

作　者: 邵阳
导　师: 杜春梅；刘秋
学　校: 黑龙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋放线菌 分离 抗菌活性 16S rDNA 鉴定 多样性
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


海泥中孕育着丰富的微生物资源,包括能产生各种次级代谢产物的海洋放线菌。本文采用9种分离培养基对大连海域13个不同采样地点的海泥样品进行放线菌分离,通过湿热处理及不处理2种方法,以制霉菌素和重铬酸钾为抑制剂,共分离到165株海洋放线菌。结果表明,在9种分离培养基中,LSE-SE-2为最有效的分离培养基,其次分别为燕麦培养基、M2培养基及HV-2培养基,而M13是分离到放线菌数目最少的培养基。两种处理方法分离到的放线菌数目基本相同,湿热处理后的海泥分离到85株海洋放线菌,未经任何处理的海泥分离到80株海洋放线菌。对分离到的165株放线菌进行抗菌活性测定,结果表明有89株放线菌具有拮抗活性,占总分菌数的54%,其中对大肠杆菌具有活性的菌株26株,占总菌株数的16.4%,对金黄色葡萄球菌具有活性的菌株85株,占总菌株数的51.5%,对尖孢镰刀菌具有活性的菌株仅有6株,占总菌株数的3.6%。对具有抗菌活性或形态独特的95株放线菌进行16S rDNA序列分析,结果表明,95株海洋放线菌可分为两大类,即链霉菌属和拟诺卡氏菌属。通过构建95株海洋放线菌的16S rDNA系统发育树,表明从大连海域海泥中分离到的海洋放线菌具有多样性,共分为37类链霉菌和4类拟诺卡氏菌;而通过构建对大肠杆菌具有拮抗活性的菌株的16S rDNA系统发育树,表明这些菌株分属于13类链霉菌和3类拟诺卡氏菌;同样的,通过系统发育分析,可以将对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性的菌株分为29类链霉菌和4类拟诺卡氏菌。全部测序菌株与NCBI数据库进行比较,16株海洋放线菌的16S rDNA序列相似度低于99%,结合16株放线菌的形态特征、培养特征、生理生化特征,确定这16株放线菌分别为Streptomyces matensis(HA5)、Streptomyces albogriseolus(HC7)、Streptomyces globisporus(M8)、Streptomyces hawaiiensis(M76)、Streptomyces macrosporus(M77)、Nocardiopsis dassonvillei(MH28,PH26)、Streptomyces parvus(PH33)、Nocardiopsis terrae(HV3)、Streptomyces fimicarius(HW27)、Streptomyces pluricolorescens(HW66)、Streptomyces fradiae(HL9)、Nocardiopsis aegyptia(HE9)、Streptomyces rubiginosohelvolu(sHE16)、Streptomycescoelicoflavus(HE18)、Streptomyces cinereorectus(HE55)。其中菌株MH28和PH26最终鉴定为同一菌株,都是Nocardiopsis dassonvillei。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-10
第1章 绪论  10-22
  1.1 海洋放线菌研究概述  10-13
    1.1.1 海洋放线菌的分布  10-11
    1.1.2 海洋放线菌的生物活性物质  11-13
  1.2 海洋放线菌的筛选方法  13-16
    1.2.1 培养基的选择  13-14
    1.2.2 预处理技术  14-15
    1.2.3 抑制剂的选择  15-16
    1.2.4 噬菌体用于分离稀有放线菌  16
  1.3 放线菌的多相分类方法  16-20
    1.3.1 表型信息  17-18
    1.3.2 基因型信息  18-19
    1.3.3 系统发育信息  19-20
  1.4 论文设计思路  20-21
  1.5 本研究的主要技术路线  21-22
第2章 材料与方法  22-34
  2.1 试验材料  22-28
    2.1.1 试验样品  22
    2.1.2 抗菌活性筛选待测菌株  22-23
    2.1.3 抗菌活性筛选指示菌  23
    2.1.4 主要药品  23-24
    2.1.5 海洋放线菌分离培养基  24-26
    2.1.6 主要仪器  26-27
    2.1.7 主要试剂及缓冲液的配制  27-28
    2.1.8 待鉴定菌株  28
  2.2 试验方法  28-34
    2.2.1 样品预处理  28-29
    2.2.2 海泥样品中放线菌的分离培养  29-30
    2.2.3 可培养放线菌的抗菌活性筛选  30
    2.2.4 放线菌基因组DNA 提取  30-31
    2.2.5 放线菌16S rDNA 的PCR 扩增  31-32
    2.2.6 放线菌的16S rDNA 测序分析  32
    2.2.7 代表菌株形态特征和培养特征观察  32
    2.2.8 代表菌株的生理生化特征  32-33
    2.2.9 海洋放线菌多样性分析  33
    2.2.10 海洋拮抗放线菌多样性分析  33-34
第3章 结果与分析  34-69
  3.1 可培养放线菌的分离  34-38
    3.1.1 不同海泥样品中海洋放线菌的分离  35-36
    3.1.2 预处理方法对海泥样品中海洋放线菌分离的影响  36-37
    3.1.3 不同培养基中海洋放线菌的分离  37-38
  3.2 可培养放线菌的抗菌活性检测  38-47
    3.2.1 抗大肠杆菌活性检测  38-39
    3.2.2 抗金黄色葡萄球菌活性检测  39-40
    3.2.3 抗尖孢镰刀菌活性检测  40-47
  3.3 放线菌DNA 提取及16S rDNA 的PCR 扩增  47-48
    3.3.1 放线菌基因组DNA 提取  47
    3.3.2 16S rDNA 的PCR 扩增  47-48
  3.4 16S rDNA 序列分析  48-52
  3.5 代表菌株的形态特征  52-57
  3.6 代表菌株的生理生化特点  57-64
    3.6.1 菌株的耐盐性  57-58
    3.6.2 菌株生长的温度  58-60
    3.6.3 菌株生长的pH  60-61
    3.6.4 菌株的生理生化鉴定  61
    3.6.5 菌株的碳源利用情况  61-64
  3.7 海洋放线菌多样性分析  64-66
  3.8 海洋拮抗放线菌多样性分析  66-69
第4章 讨论  69-73
  4.1 海洋放线菌的分离和筛选研究  69-71
    4.1.1 不同采样地点对放线菌分离的影响  69-70
    4.1.2 分离方法对放线菌分离的影响  70-71
  4.2 可培养海洋放线菌对不同测试菌的抑菌活性研究  71
  4.3 代表菌株的系统发育分析  71-72
  4.4 海洋放线菌多样性研究  72-73
第5章 结论  73-74
参考文献  74-81
附录1  81-84
附录2  84-86
附录3  86-88
致谢  88-89
攻读学位期间发表的学术论文  89

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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