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牛分枝杆菌Mb1761c和Mb2277基因表达产物免疫原性及其在ELISA方法中的初步应用的研究

作　者: 刘芳
导　师: 朱建国；华修国
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛分枝杆菌 分泌蛋白 原核表达 免疫原性 酶联免疫吸附
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
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内容摘要


牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,MTB)引起的一种人兽共患传染病,它严重危害人的健康和畜牧业的发展,且导致巨大的经济损失。因此,对牛结核病的防控显得格外的重要。然而,缺乏可用于检测结核杆菌的特应性靶标分子及用于研制有效疫苗的候选分子是结核病防治面临的棘手问题,因此,发掘这些重要分子就成了结核病防治研究的热点。分泌蛋白是目前研究较多的结核杆菌特异性抗原,本实验筛选出Mb1761c和Mb2277两个分泌蛋白,在利用生物信息学方法对其信号肽和疏水跨膜区进行分析的基础上,通过实验生物学方法,对其表达免疫原性进行了验证。本研究主要分为以下两个方面的内容:(1)牛分枝杆菌Mb1761c和Mb2277蛋白的免疫原性的初步研究。根据GenBank提供的Mb1761c和Mb2277的基因序列设计引物,通过PCR方法扩增出目的基因,构建重组表达质粒,原核诱导表达后,利用Western-Blot对表达产物的免疫原性进行验证。结果表明目的蛋白具有较强的免疫原性,从而为进一步研究其亚单位疫苗及ELISA检测方法提供了候选蛋白。(2)重组蛋白在ELISA检测方法中的初步应用研究。将筛选得到的两个具有较强免疫原性的蛋白分子Mb1761c和Mb2277作为抗原,分别进行ELISA实验。结果表明Mb2277的灵敏性较强。将两个蛋白按照不同比例混合作为包被抗原,结果显示将两种重组蛋白按1:1混合包被,ELISA的灵敏度高于单个抗原包被的。本研究筛选鉴定了分枝杆菌两个具有免疫原性的蛋白分子,为进一步建立结核杆菌的ELISA检测方法和研制新型疫苗奠定了基础。

全文目录


摘要  2-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-8
符号说明  8-9
第一章 绪论  9-26
  1 牛结核病概述  9-12
    1.1 牛结核病的现状  9-10
    1.2 病原及流行病学的研究  10-11
    1.3 诊断方法的研究  11-12
  2 分泌蛋白的研究进展  12-26
    2.1 结核分枝杆菌分泌蛋白的组成  12-13
    2.2 结核分枝杆菌分泌蛋白的生物学功能  13-14
    2.3 结核分枝杆菌几种分泌蛋白研究进展  14-17
    2.4 结核分枝杆菌分泌蛋白的研究方法  17-20
    2.5 结核分枝杆菌分泌蛋白在临床诊断中的应用  20-21
    2.6 结核分枝杆菌分泌蛋白在疫苗中的应用  21-24
    2.7 前景展望  24-25
    2.8 研究目的与意义  25-26
第二章 牛分枝杆菌Mb1761c 和Mb2277 蛋白的表达及其免疫原性的初步研究  26-44
  1 材料  26-28
    1.1 实验菌株  26
    1.2 阳性血清  26
    1.3 主要试剂  26-27
    1.4 主要仪器  27
    1.5 主要溶液的配制  27-28
  2 实验方法  28-34
    2.1 引物设计与合成  29
    2.2 目的基因的扩增及纯化  29-31
    2.3 PCR 产物和pET28a(+)的酶切  31
    2.4 目的基因与载体连接  31
    2.5 重组质粒的转化  31-32
    2.6 重组质粒的提取  32-33
    2.7 挑选阳性克隆并鉴定  33
    2.8 原核表达载体的构建和鉴定  33
    2.9 目的蛋白的诱导表达  33-34
    2.10 Western-blot 检测重组蛋白的抗原性  34
  3 实验结果  34-42
    3.1 生物信息学分析结果  34-37
    3.2 Mb1761c 和Mb2277 基因扩增结果  37-38
    3.3 重组克隆载体的测序与鉴定  38-40
    3.4 原核表达质粒的构建和酶切鉴定  40
    3.5 重组质粒的诱导表达结果  40-42
    3.6 Western-blot 检测重组蛋白的抗原性  42
  4 讨论  42-44
第三章 重组蛋白在ELISA 检测方法中的初步应用研究  44-55
  1. 材料  44-45
    1.1 重组表达菌株  44
    1.2 血清  44
    1.3 主要试剂及仪器  44-45
    1.4 主要溶液的配制  45
  2. 实验方法  45-48
    2.1 重组蛋白的纯化  45-46
    2.2 重组抗原初步应用于ELISA 方法  46-48
  3. 实验结果  48-53
    3.1 重组蛋白的纯化  48-49
    3.2 重组抗原ELISA 方法的初步研究  49-52
    3.3 不同包被抗原敏感性的比较  52-53
  4 讨论  53-55
第四章 结论  55-56
参考文献  56-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表的学术论文目录  65-67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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