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梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用

作　者: 匡有吉
导　师: 郭爱珍
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛分枝杆菌梅花鹿结核胶体金酶联免疫反应抗体 CFP10 ESAT6 MPB7O MPB83 RV3872
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

牛结核病（Bovine Tuberculosis,bTB）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）引起的一种人兽共患传染病。被国际动物卫生组织（Office International DesEpizooties,OIE）定为B类动物传染病,我国将其列为二类动物疫病。国内外的人结核病原学调查均发现,牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出:除非消灭牛结核,否则人类结核病的控制是不会成功的。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治,目前普遍采用的是“检疫-捕杀”政策,即检疫出的阳性牛一律捕杀来控制牛结核病。因此,准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应（Tuberculin skin test,TST）,结核菌素又称为纯化蛋白衍生物（purified protein derivatives,PPD）,是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质,含有多种抗原成分,用于检测结核病时敏感性较高。但由于结核菌素包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份,检测时容易出现假阳性;结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。因此,研究更加敏感特异的结核病新型诊断抗原和诊断方法,是控制牛结核病当务之急。梅花鹿是特种经济动物,在人工饲养条件下可以生产繁殖,其主要产品鹿茸,被称为“东北三宝”之一,具有很高的经济价值。一些学者中认为鹿是牛结核的次要宿主,近年来对鹿的牛结核流行病学调查表明,在人工饲养的鹿场中牛结核种内感染的危险系数增加。感染了牛结核的梅花鹿产茸量下降,身体消瘦,对经济和公共卫生产生不利影响。对于野生动物,使用皮内结核菌素检测结核病时受到许多的限制,野生动物难以捕捉,每一物种的使用剂量及阳性判定没有统一标准,同时,TST本身也存在很大的缺陷。因此,研究敏感特异的梅花鹿结核新型诊断抗原和诊断方法,是控制梅花鹿结核病的当务之急。牛分枝杆菌（M.bovis）是细胞内寄生菌,RV3872、CFP-10和ESAT-6是M.bovis感染机体后分泌的主要抗原,诱导机体产生相应抗体。当用单个抗原检测其抗体水平反映牛结核感染状况时,灵敏度较低。经过大量研究证实“鸡尾酒”试验比任何单一抗原都要强,而且随着抗原数量的增多而增强。但“鸡尾酒”诊断方法中多种蛋白抗原生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题也已凸显出来,鉴于以上原因,本研究之一是对三种牛分枝杆菌抗原蛋白（RV3872、CFP-10和ESAT-6）进行了融合表达,旨在为牛结核病临床诊断提供一种敏感、特异的诊断抗原。CFP-10和ESAT-6已被证明是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原,仅存在于致病性结核杆菌中,而在BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。而且在结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌中同源性达到100%,许多研究已经证实是非常有前景的鉴别诊断抗原,可以区分结核分枝杆菌（Mycobacterial tuberculosis,MTB）自然感染还是接种了卡介苗（Bacillus Calmette Guerin,BCG）。其融合蛋白CE（cfp10-esat6）具有单个抗原的免疫学活性。胶体金免疫层析技术（Gold-Immunochromatographic Assay GICA）是近20年发展起来的一项免疫学检测技术。该技术不仅特异性强、敏感性高,而且不需昂贵仪器设备,操作简单快速。本论文利用融合蛋白CE（cfp10-esat6）建立了一种胶体金免疫层析法,旨在为牛结核病的临床诊断提供一种敏感、特异、快速、实用的新型诊断方法;同时克隆了RV3872基因,表达了RV3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白。主要研究内容归纳如下:1.表达和纯化CFP-10-ESAT-6融合蛋白并对其相关特性进行分析诱导表达融合蛋白CE（cfp10-esat6）,提纯蛋白质,并对其特性及其在牛结核病血清学诊断中的价值进行了初步评估。经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白CE（cfp10-esat6）的多抗反应,说明该融合蛋白具有两个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白具有与单个蛋白相同的热稳定性。结果显示,融合蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。2.牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立利用胶体金免疫层析技术原理,用融合蛋白CE（cfp10-esat6）作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果波长为524nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为7.5;抗原最适标记量为每毫升胶体金0.96μg;抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗CE（cfp10-esat6）蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL,抗体效价为1:2¹⁰;交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。3.梅花鹿结核特异性抗体间接ELISA检测方法的建立建立了MPB83-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA和MPB70-83-CE-ELISA,抗原包被浓度分别为100ng/mL,500ng/mL,500ng/mL和血清稀释度分别为1:800,1:200,1:200。OD₆₃₀临界值分别为0.4,0.5,0.5。重复试验表明建立的梅花鹿结核特异抗体ELISA检测具有良好的可重复性。4.牛分枝杆菌特异性抗体间接ELISA方法和胶体金快速检测技术的临床应用应用牛结核病胶体金抗体检测试纸条检测637份梅花鹿血清,同时用间接ELISA方法检测相同样品。结果表明它们之间有很高的符合率,为92.15%,快速检测牛分枝杆菌抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,在牛分枝杆菌的检测方面,具有良好的应用前景。5.RV3872、CFP-10和ESAT-6的融合表达酶切回收pET28a-cfp-10-esat6和pMD19-RV3872 T载体目的片段,然后将回收的pET28aCFP-10-ESAT-6线性片段、RV3872基因片段和退火的双链adapter进行连接反应,连接产物转化DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET28aRV3872-CFP-10-ESAT-6,质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-14
缩略语表(Abbreviation)  14-15
1 前言  15-28
  1.1 牛结核病的流行现状及危害  16-17
  1.2 牛结核病的发现及病原  17-18
  1.3 牛结核病的流行病学  18-19
  1.4 临床症状  19
  1.5 免疫与发病机理  19-20
  1.6 机体抗牛分枝杆菌感染的免疫机理  20-21
  1.7 牛结核病的诊断  21-28
    1.7.1 牛结核病诊断抗原的研究  21-23
    1.7.2 牛结核病诊断方法的研究  23-28
2 研究目的与意义  28-30
3 材料与方法  30-49
  3.1 试验材料  30-35
    3.1.1 质粒及菌株  30-31
    3.1.2 血清及抗原蛋白  31
    3.1.3 主要试剂及材料  31-32
    3.1.4 质粒抽提与鉴定试剂的配制  32
    3.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制  32-33
    3.1.6 克隆表达融合蛋白其它试剂的配制  33-34
    3.1.7 ELISA相关溶液的配制  34
    3.1.8 寡核苷酸引物  34-35
  3.2 牛分枝杆菌抗原RV3872、RV3872-CFP-10-ESAT-6融合基因的克隆表达方法  35-43
    3.2.1 PCR扩增RV3872基因  35
    3.2.2 PCR产物的回收与纯化  35-36
    3.2.3 连接pMD19-T Vector  36
    3.2.4 PCR鉴定pMD19-T Vector  36-37
    3.2.5 感受态细胞的制备(氯化钙法)  37
    3.2.6 质粒的转化  37-38
    3.2.7 质粒的制备  38-39
    3.2.8 重组质粒pET28aVR3872-CFP-10-ESAT-6的构建  39-41
    3.2.9 重组质粒的诱导表达、SDS-PAGE分析和重组蛋白质的纯化  41-43
    3.2.10 融合蛋白的性质分析  43
  3.3 胶体金免疫层析方法的建立  43-49
    3.3.1 CFP10-ESAT-6-胶体金复合物制备及纯化  43-44
    3.3.2 质控线兔抗CE蛋白IgG的制备与提纯  44-45
    3.3.4 免疫层析法的建立  45-48
    3.3.5 试纸条稳定性试验制备  48-49
4 结果与分析  49-69
  4.1 牛分枝杆菌抗原RV3872、和RV3872-CFP-10-ESAT-6的融合基因的克隆表达结果  49-53
    4.1.1 RV3872的PCR产物和目的基因片段的酶切回收产物  49-50
    4.1.2 重组质粒和pET28aRV3872-CFP-10-ESAT-6的鉴定  50-51
    4.1.3 目的基因片段的序列分析  51
    4.1.4 诱导表达重组蛋白及其纯化  51-53
    4.1.5 融合蛋白的热稳定性分析  53
  4.2 牛结核病胶体金免疫层析方法建立结果  53-69
    4.2.1 胶体金的制备  53-54
    4.2.2 最适标记胶体金pH值的确定  54-55
    4.2.3 最适标记抗原量的确定  55-56
    4.2.4 质控线兔抗CE蛋白IgG提纯  56
    4.2.5 检测线抗原和质控线IgG最佳包被浓度的确定  56-57
    4.2.6 试纸条结果  57-58
    4.2.7 试纸条特异性试验  58-59
    4.2.8 试纸条敏感性试验  59-60
    4.2.9 与韩国进口试纸条比较试验  60-61
    4.2.10 梅花鹿结核特异性抗体ELISA检测方法的建立  61
    4.2.11 MPB70-83试纸条与MPB-83-ELISA的比较试验  61-62
    4.2.12 CE试纸条与CE-ELISA的比较试验  62-63
    4.2.13 CE试纸条与MPB70-83试纸条的比较试验  63-64
    4.2.14 CE-ELISA与83-ELISA的比较试验  64-65
    4.2.15 四种抗原试纸条与ELISA联合检测结果的比较分析  65-66
    4.2.16 不同抗原ELISA的比较试验  66-67
    4.2.17 83-ELISA联合CE-ELISA与70-83-CE-ELISA的比较试验  67-68
    4.2.18 试纸条稳定性试验  68-69
5 讨论  69-73
  5.1 融合蛋白的克隆表达及特性探讨  69-70
    5.1.1 融合蛋白克隆表达  69-70
    5.1.2 融合蛋白特性分析  70
  5.2 胶体金免疫层析方法的建立与应用探讨  70-73
    5.2.1 间接法和夹心法的选择  70-71
    5.2.2 抗原蛋白的选择  71
    5.2.3 材料和试剂的选择  71
    5.2.4 胶体金免疫层析方法的建立  71-72
    5.2.5 胶体金免疫层析方法的应用  72
    5.2.6 检测结果分析  72-73
6 结论  73-74
参考文献  74-84
致谢  84

梅花鹿结核抗体检测方法的建立和应用

内容摘要

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