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人类杯状病毒的pET-28a（+）-SVA构建及高效表达和LAMP法检测

作　者: 陈宗峰
导　师: 黄祖新
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人类杯状病毒 诺如病毒 札如病毒 克隆 衣壳蛋白表达 环介导等温扩增
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


人类杯状病毒(Human caliciviruses,HucV)包括诺如病毒属(NV)和札如病毒属(SV),是导致胃肠炎和病毒性腹泻的重要病毒之一。目前分离和研究较多的是NV,而SV国内基础研究资料的匮乏,给病毒的检测和疫苗的研制带来了很多困难。本课题研究工作的目的在于:构建SV原核表达载体,并以此为代表表达人类杯状病毒衣壳蛋白,同时建立环介导等温扩增技术检测方法。对认识病毒感染的本质,快速诊断,研制疫苗以及抗病毒药物提供重要的基础资料,对了解婴幼儿腹泻的发病机制及疾病的预防具有重大的指导意义。本课题包括两个部分:一是对人类杯状病毒衣壳基因序列进行人工合成、然后克隆构建原核表达载体,并表达。二是建立环介导等温扩增技术检测人类杯状病毒的方法。一、设计引物,人工合成SV衣壳基因,TA克隆后测定其核苷酸序列。将其定向克隆入pET-28a(+)载体,构建新的原核表达载体,经菌落PCR和酶切鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过适当的培养基组成、接种量、诱导OD值、IPTG浓度和诱导时间等因素表达SV衣壳蛋白。最后,收集菌体,破菌,离心,分离上清和包涵体。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在。Western-blotting结果显示,SV蛋白能够特意地与六组氨酸抗体发生免疫反应,在15kd处有一条明显的条带。二、环介导等温扩增(简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。本实验建立了环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测人类杯状病毒的方法,该方法与传统PCR方法相比,LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测腹泻病毒快速简便的新方法。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-8
目录  8-12
绪论  12-26
  第一节 人类杯状病毒研究现状及意义  12-16
    1.人类杯状病毒的分类和命名  12
    2.人类杯状病毒的分子生物学特征  12-13
    3.人类杯状病毒分子流行病学研究概况  13-14
    4.人类杯状病毒的疫苗研究现状  14-15
    5.人类杯状病毒的检测方法  15-16
      5.1 经典检测技术  15
      5.2 酶联免疫吸附检测技术  15-16
      5.3 基因检测技术  16
  第二节 环介导等温扩增技术(LAMP)  16-23
    1.环介导等温扩增技术简介  16-17
    2.LAMP反应引物设计  17-18
    3.LAMP反应原理  18-21
    4.LAMP反应特点  21-22
    5.LAMP技术的应用  22-23
      5.1 对DNA病毒的检测  22
      5.2 对RNA病毒的检测  22-23
      5.3 对细菌的检测  23
      5.4 对真菌的检测  23
  第三节 课题研究的意义及前景  23-26
第一章 札如病毒的pET-28a(+)-SVA的构建  26-44
  第一节 前言  26
  第二节 材料与方法  26-37
    1.材料  26-28
      1.1 载体和菌株  26
      1.2 人工合成SVA基因序列的引物  26-27
      1.3 培养基  27
      1.4 主要仪器与试剂  27-28
    2.方法  28-37
      2.1 SV氨基酸序列的选取及碱基序列的翻译  28-30
      2.2 人工合成SVA基因序列的模板反应体系  30-31
      2.3 人工合成SVA基因序列的模板反应条件  31-32
      2.4 SVA的PCR产物加A尾:  32
      2.5 SVA基因片段的TA克隆  32-33
      2.6 质粒抽提  33-34
      2.7 分别酶切pMD19-T-SVA和pET28a(+)  34
      2.8 DNA片段的凝胶回收  34-35
      2.9 SVA目的片段与pET28a(+)载体的连接及pET28a(+)-SVA的转化  35
      2.10 重组质粒pET28a(+)-SVA的筛选  35-36
      2.11 植菌和提质粒酶切鉴定  36
      2.12 重组质粒pET28a(+)-SVA的转化及鉴定  36-37
  第三节 结果与讨论  37-42
    1.pET28a(+)-SVA载体构建原理(见图1-1):  37-38
    2.人工合成SVA基因序列  38
    3.SVA基因序列的PCR扩增  38-39
    4.SVA基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳  39
    5.SVA基因片段的TA克隆和克隆质粒测序  39-40
    6.酶切pET28a(+)和克隆质粒pMD19-T-SVA  40
    7.表达质粒pET28a(+)和SVA基因片段的连接和转化  40
    8.重组表达质粒的菌落PCR及酶切鉴定  40-41
      8.1 重组表达质粒的菌落PCR鉴定  40-41
      8.2 重组表达质粒的酶切鉴定  41
    9.重组表达质粒测序及分析  41-42
  第四节 结论  42-44
第二章 SVA基因蛋白的表达和鉴定  44-54
  第一节 前言  44
  第二节 材料与方法  44-49
    1 材料  44-45
      1.1 菌种  44
      1.2 培养基  44
      1.3 主要仪器与试剂  44-45
      1.4 配制液  45
    2 方法  45-49
      2.1 表达菌株的筛选和目的蛋白的诱导表达  45-46
      2.2 SDS-PAGE电泳  46-48
      2.3 考马斯亮蓝染色  48
      2.4 Western blotting  48
      2.5 抗体反应及显色反应  48-49
  第三节 结果与讨论  49-51
    1.SVA基因片段的诱导表达  49
      1.1 筛选表达菌株  49
      1.2 诱导表达  49
    2.SVA蛋白的SDS-PAGE电泳检测  49-50
    3.Western blotting  50-51
  第四节 结论  51-54
第三章 环介导等温扩增(LAMP)检测人类杯状病毒  54-78
  第一节 前言  54
  第二节 材料与方法  54-66
    1.材料  54-57
      1.1 试剂  54
      1.2 样本  54-55
      1.3 引物  55-57
    2.方法  57-66
      2.1 病毒RNA抽提  57-58
      2.2 病毒RNA反转录反应  58
      2.3 引物设计  58-59
      2.4 LAMP扩增反应条件及优化  59
      2.5 LAMP反应的特异性的判断  59-60
      2.6 LAMP方法检测的灵敏度  60-61
      2.7 Norwalk virus菌株的人工基因序列的合成及PCR  61-63
      2.8 人工基因片段凝胶回收  63
      2.9 人工基因片段的PCR产物加A尾  63
      2.10 NVA基因片段的TA克隆  63-64
      2.11 质粒DNA抽提  64
      2.12 分别酶切pMD19-T-NVA和pET28a(+)  64
      2.13 NVA基因片段与pET28a(+)载体的连接和转化  64-65
      2.14 重组质粒pET28a(+)-NVA的筛选  65
      2.15 重组质粒pET28a(+)-NVA酶切鉴定  65-66
      2.16 以重组质粒pET28a(+)-NVA体外转录成mRNA  66
      2.17 LAMP扩增产物的显色反应  66
  第三节 结果与讨论  66-76
    1.LAMP反应引物示意图及其基因扩增结果  66-68
    2.LAMP反应条件优化  68-70
      2.1 Mg2~+浓度  68-69
      2.2 反应温度  69-70
      2.3 反应时间  70
    3.LAMP反应特异性  70-71
      3.1 LAMP扩增产物特异性  70-71
      3.2 LAMP引物特异性  71
    4.LAMP法检测的灵敏度  71-72
    5.显色反应  72-73
    6.LAMP法和RT-PCR法检测诺如病毒的结果比较  73-75
    7.LAMP法检测札如病毒结果  75-76
  第四节 结论  76-78
第四章 结论  78-80
附录1  80-82
附录2  82-84
参考文献  84-90
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  90-92
致谢  92-94
个人简历  94-95

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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