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嗜线虫沙雷氏菌菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性相关生物学特性及杀虫毒素蛋白的分离纯化

作　者: 刘敬瑞
导　师: 张克云
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物学
关键词: 嗜线虫沙雷氏菌 大蜡螟 杀虫毒素蛋白 分离纯化
分类号: S476.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 14次
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内容摘要


昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内,二者互惠共生。昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含3个属：致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)和沙雷氏菌属(Serratia),分别与斯氏科(Steinernematidae)、异小杆科(Heterorhabditidae)和小杆科拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoides chongmingensis)线虫共生。昆虫病原线虫共生菌为目前已发现的抗虫基因最多的细菌,其分泌的杀虫毒素蛋白对多种害虫具有杀伤作用,昆虫病原线虫共生菌已成为一类新的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。为寻找新的杀虫毒素资源,本研究对本实验室分离的昆虫病原线虫共生菌新种嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)的模式菌株DZ0503SBS1T的杀虫活性进行评价,研究其杀虫活性相关生物学特征,开展了杀虫毒素蛋白的分离纯化工作。主要研究内容如下：共生菌菌株DZ0503SBS1T的生长曲线测定表明符合一般细菌的生长规律,共生菌在对数生长初期即产生胞外杀虫蛋白,在对数生长末期杀虫活力达到最大,在发酵26h时死亡率为100%,所以最优发酵时间为26h。以大蜡螟为生测昆虫,对共生菌发酵液上清液对大蜡螟初孵幼虫和老熟幼虫的毒力进行测定,在100μg·g-1人工饲料时,96h后初孵幼虫校正死亡率为36.84%。体重抑制率为50.64%。老熟幼虫以10μl／头注射血腔内,12h后校正死亡率为94.74%。共生菌菌体以1000个／头、100个／头、10个／头注射大蜡螟老熟幼虫血腔内,12小时后的校正死亡率分别为88.89%、63.16%和42.11%。发酵液上清液中的杀虫物质对热比较稳定,60度处理30min后活力减小不大,死亡率仍达到80%；对蛋白酶K敏感,上清液蛋白酶K水解处理后杀虫活力下降40%。共生菌胞外杀虫蛋白粗提物对大蜡螟初孵幼虫的胃毒毒力很高,在100μg·g-1人工饲料时,校正死亡率达到55%,生长抑制率也为74.67%。说明我们分离得到的共生菌胞外杀虫活力非常强。在将杀虫蛋白粗提物冻干粉OD280稀释为0.1,用微量注射器将稀释好的杀虫蛋白粗提物10μL注射到大蜡螟的血腔内,8h后大蜡螟校正死亡率为100%。胞外杀虫蛋白粗提物冻干粉经Sephadex G-75凝胶过滤出现3个峰,检测胃毒活力时冻干粉以20μg·g-1加入人工饲料,实验结果显示峰2为活性峰,96h校正死亡率为50%,体重抑制率为86.30%。检测血腔毒力时以1μg·μl-1杀虫蛋白冻干粉注射大蜡螟,结果峰2为活性峰,12h的校正死亡率为68.42%。过DEAE--Sephacryl阴离子交换柱,得到3个峰,检测胃毒活力时冻干粉以20μg·g-1人工饲料,峰3为活性峰,校正死亡率为45%。体重抑制率为48.43%。检测血腔毒力时以1μg·μl-1杀虫蛋白冻干粉注射大蜡螟,峰3为活性峰,12h的校正死亡率为50%。SDS-PAGE电泳图谱显示,经过分子筛和离子柱分离纯化后的活性峰3为一明显蛋白条带,表明共生菌菌株DZ0503SBS1T的杀虫毒素蛋白由一条多肽链构成。根据蛋白Marker分子质量和电泳迁移率获得的线性曲线,结合活性峰3的电泳迁移率计算出该活性蛋白相对分子质量为49.6 kDa。由此可见,在经分子筛和离子交换后蛋白成分就比较简单,几乎没有其他杂蛋白。这为进一步分进行离纯化提供了实验基础。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-32
  1.昆虫病原线虫及其共生菌简介  10-15
    1.1 昆虫病原线虫分类现状  11-12
    1.2 昆虫病原线虫共生菌的分类  12-15
  2 昆虫病原线虫及共生菌共生的专一性  15-16
  3 共生菌与昆虫免疫  16-17
  4 昆虫病原线共生菌的代谢产物  17-23
    4.1 杀虫毒素蛋白  17-20
    4.2 抑菌物质  20-21
    4.3 抗癌物质  21
    4.4 胞外酶  21-22
    4.5 色素  22
    4.6 荧光素  22-23
  参考文献  23-32
第二章 嗜线虫沙雷氏菌菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性相关生物学特性分析  32-44
  1. 材料与方法  32-36
    1.1 试验材料、试剂及仪器设备  32-33
    1.2 昆虫病原线虫共生菌菌株DZ0503SBS1~T的分离  33-35
    1.3 不同培养时间对菌株DZ0503SBS1~T杀虫效果的影响  35
    1.4 不同培养基成分对菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性的影响  35-36
    1.5 温度和蛋白酶K对菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性的影响  36
  2. 结果与分析  36-41
    2.1 菌株DZ0503SBS1~T的分离  36-37
    2.2 菌株DZ0503SBS1~T生长曲线的测定  37
    2.3 菌株DZ0503SBS1~T发酵液上清液对大蜡螟初孵幼虫胃毒毒力测定  37-38
    2.4 菌株DZ0503SBS1~T发酵液上清液对大蜡螟老熟幼虫毒力测定  38
    2.5 菌株DZ0503SBS1~T菌体对大蜡螟老熟幼虫的毒力  38-39
    2.6 不同培养时间对菌株DZ0503SBS1~T杀虫效果的影响  39-40
    2.7 不同培养基成分对菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性的影响  40-41
    2.8 温度和蛋白酶K对菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性的影响  41
  3. 讨论  41-42
  参考文献  42-44
第三章 嗜线虫沙雷氏菌菌株DZ0503SBS1~T对大蜡螟的毒力检测  44-56
  1. 材料与方法  44-47
    1.1 实验材料、试剂及仪器设备  44-45
    1.2 菌株DZ0503SBS1~T杀虫活性的测定  45-46
    1.3 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白粗提物对大蜡螟毒力的测定  46
    1.4 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白的初步分离纯化和毒力测定  46-47
  2.结果与分析  47-52
    2.1 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白粗提物对大蜡螟初孵幼虫毒力测定  47
    2.2 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白粗提物对大蜡螟老熟幼虫毒力测定  47-48
    2.3 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白过Sephadex G-75  48-49
    2.4 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白过DEAE-Sephacryl FF anionic exchange  49-51
    2.5 菌株DZ0503SBS1~T杀虫蛋白的SDS-PAGE电泳  51-52
  3.讨论  52-53
  参考文献  53-56
本文创新之处  56-58
攻读硕士学位期间发表的学术论文  58-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫细菌
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