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黑曲霉EIM-6果胶裂解酶基因的克隆与表达

作　者: 杨欣伟
导　师: 黄建忠；田宝玉
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学和分子生物学
关键词: 黑曲霉 果胶酶组分分析 果胶裂解酶 基因克隆 生物信息学分析 异源表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


果胶酶是一种重要的工业用酶,广泛的应用于果汁处理,纺织,造纸和饲料等工业。本实验通过筛选得到一株高产果胶酶菌株EIM-6,基于形态学与ITS序列系统进化分析,初步鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger EIM-6）。在液体深层发酵条件下对黑曲霉EIM-6产果胶酶的发酵条件进行了优化,通过单因素试验结合响应面设计,确定最佳产酶培养基为:橘皮粉4.09%、麸皮2.16%、（NH4）2SO4 0.35%、K2HPO4 0.3%、CaCO30.24%,pH值=6;最佳培养条件为接种量107/mL、250r/min,28℃培养80h。优化后菌株酶活从初筛酶活力14562U/mL提高至30231U/ml,提高了2.07倍。初步中试生产的浓缩酶活力可达624,225.00U/mL,基本达到工厂酶制剂工业化生产的要求。初步的纯化结果表明黑曲霉EIM-6果胶酶的主要组分为裂解酶和聚半乳糖醛酸酶。作为果胶酶组分中唯一可以通过反式消去作用降解高酯化程度果胶物质的果胶酶,果胶裂解酶在工业上具有更为广泛的应用。本文进一步克隆了黑曲霉EIM-6果胶裂解酶基因,首先提取黑曲霉EIM-6的总RNA,根据公布的果胶裂解酶序列设计引物,反转录获得果胶裂解酶pelA全长cDNA序列。黑曲霉EIM-6 pelA cDNA序列全长1341bp,含4个内含子,一共编码379个氨基酸（含20个氨基酸的信号肽）。pelA氨基酸序列与不同来源的果胶裂解酶氨基酸序列达到80%以上的同源性,特别是在活性中心,各个家族的果胶裂解酶氨基酸序列具有完全一致的保守位点。利用生物信息学的方法对黑曲霉果胶裂解酶的氨基酸序列,氨基酸组成,疏水作用,二级结构和三级结构等方面进行了初步的分析和预测。结果显示,预测的EIM-6果胶裂解酶PLA结构与不同来源的黑曲霉果胶裂解酶A结构十分吻合,它的结构特征也满足于分泌酶的特性。黑曲霉EIM-6果胶裂解酶A基因分别亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a和毕赤酵母表达系统pPIC3.5K进行异源表达。重组大肠杆菌表达载体pET-30a-pelA转入E.coli BL21,IPTG诱导,首先在大肠杆菌中成功表达,但重组的裂解酶以无活性的包涵体形式存在,且无法实现再折叠复性。之后,将全长果胶裂解酶A编码基因克隆到pPIC3.5K载体上,转化P.pastoris GS115。经甲醇诱导,SDS-PAGE电泳分析,P.pastoris GS115产生90%以上的分子量约为38kDa的单一分子大小的重组果胶裂解酶。发酵上清液果胶裂解酶酶活为24 U/ml,与黑曲霉EIM-6直接发酵产生的果胶裂解酶活性相比,酶活提高约50倍。利用HCl法测定重组果胶裂解酶的最适作用温度为45℃,最适pH为5.2。重组的黑曲霉果胶裂解酶有较大的工业应用价值。

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-9
目录  9-13
绪论  13-33
  第一节 课题背景  13-19
    1.1 果胶  13-14
    1.2 果胶酶  14-18
    1.3 果胶酶的应用  18-19
  第二节 果胶裂解酶  19-25
    2.1 酶活测定方法  19-20
    2.2 果胶裂解酶基因家族  20
    2.3 果胶裂解酶基因的启动子分析  20-21
    2.4 果胶裂解酶基因的表达与定位  21-22
    2.5 果胶裂解酶的纯化  22-23
    2.6 果胶裂解酶的酶学性质及其晶体结构  23-24
    2.7 果胶裂解酶的应用  24-25
  第三节 提高果胶酶产量和活性的方法  25-30
    3.1 果胶酶基因的微生物来源与菌种诱变  25-26
    3.2 果胶酶发酵工程的研究  26-27
    3.3 果胶酶基因异源表达系统  27-30
  第四节 课题的研究内容、意义及其创新点  30-33
    4.1 课题研究内容  30-31
    4.2 课题研究的目的与意义  31
    4.3 课题研究的创新点  31-33
第一章 果胶酶高产菌株EIM-6的筛选及其分子鉴定  33-43
  第一节 材料与方法  33-39
    1.1 材料  33-35
    1.2 实验方法  35-39
  第二节 结果与分析  39-42
    2.1 果胶酶产生菌EIM-6的筛选  39
    2.2 菌种的形态鉴定  39
    2.3 ITS rDNA基因的扩增与鉴定  39-40
    2.4 ITSrDNA基因的同源性分析  40-41
    2.5 ITS rRNA基因序列测定及系统进化树分析  41-42
  第三节 小结与讨论  42-43
第二章 响应面法优化EIM-6液体发酵产酶条件  43-63
  第一节 材料与方法  43-48
    1.1 材料  43-45
    1.2 实验方法  45-48
  第二节 结果与分析  48-62
    2.1 果胶酶活力曲线  48
    2.2 单因素试验优化  48-49
    2.3 Plackett-Burman试验设计  49-52
    2.4 最陡坡试验  52-53
    2.5 中心组合设计试验结果及响应面模拟  53-54
    2.6 二次响应面回归模型的建立  54-57
    2.7 最优发酵配方组合的验证  57-58
    2.8 发酵流程与结果  58-60
    2.9 工厂发酵成品果胶酶的初步纯化  60-61
    2.10 SDS-PAGE鉴定与酶活测定  61-62
  第三节 小结与讨论  62-63
第三章 果胶裂解酶基因的克隆及其结构分析  63-75
  第一节 材料与方法  63-67
    1.1 材料  63-64
    1.2 实验方法  64-67
  第二节 结果与分析  67-74
    2.1 果胶裂解酶A基因的PCR扩增  67-68
    2.2 果胶裂解酶基因及其氨基酸序列分析  68-70
    2.3 果胶裂解酶氨基酸序列的聚类分析  70
    2.4 果胶裂解酶氨基酸序列的同源性比较  70-71
    2.5 PLA的信号肽预测分析  71-72
    2.6 PLA的理化表征分析  72
    2.7 PLA的疏水性和跨膜分析  72-73
    2.8 PLA的同源模建分析  73-74
  第三节 小结与讨论  74-75
第四章 黑曲霉EIM-6果胶裂解酶基因的异源表达  75-93
  第一节 材料与方法  75-84
    1.1 材料  75-77
    1.2 实验方法  77-84
  第二节 结果与分析  84-91
    2.1 果胶裂解酶编码基因的亚克隆  84
    2.2 果胶裂解酶pelA在大肠杆菌中的表达  84-86
    2.3 果胶裂解酶pelA在毕赤酵母中的表达  86-91
  第三节 小结与讨论  91-93
第五章 结论  93-95
附录  95-97
参考文献  97-105
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  105-107
致谢  107-109
个人简历  109

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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