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中温α-淀粉酶基因的异源表达及发酵条件的优化

作　者: 孙静
导　师: 路福平
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶 PCR 克隆与表达酶学性质发酵优化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文以产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF7658为研究对象,通过PCR技术获得了该菌的α-淀粉酶基因(amy),并成功的将该基因克隆到六蛋白酶缺陷菌株WB600中,实现了中温α-淀粉酶的高效表达,经过优化、放大培养后,工程菌所产酶活力比原出发菌株提高3.9倍。首先将获得的中温α-淀粉酶基因插入到大肠杆菌载体pET-22b(+)中,构建重组载体pET-amy并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。测序并对序列进行分析。该基因(Genebank接收号FJ463162)不含有信号肽,包含1,431个碱基,编码447个氨基酸。与GenBank中已报道的α-淀粉酶基因进行了比较,发现基因核苷酸序列相似性最高为92%,氨基酸序列的相似性最高为94%。以质粒pET-amy为模板,通过PCR技术扩增得到中温α-淀粉酶基因(amy)成熟肽,利用含有P43启动子,sacB信号序列,多克隆位点和卡那抗性基因的表达载体pWB980,构建重组表达质粒pWB-amy,以六蛋白酶缺陷菌株B. subtilis WB600作为宿主菌,首次实现了去信号肽的枯草芽孢杆菌BF7658中温α-淀粉酶基因(amy)在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达。经SDS-PAGE检测,重组酶(AMY)的分子质量为49.1 KDa,最适的作用温度和pH分别为60℃和6.0。该酶的酶活较出发菌株提高了184.2%。通过正交试验确定培养基最佳组合为豆饼粉3%、玉米粉5%、淀粉5%、氯化钙0.2%。摇瓶培养条件最佳组合为起始pH6.0、接种种龄18 h、接种量2%、装液量50 mL(500 mL三角瓶)、摇床转速220 r／min。基因工程菌株pWB-amy／WB600在最佳产酶条件下,产α-淀粉酶的活力最高可达630 U／mL,是优化前的1.5倍。初步确定了7L发酵罐上的工艺条件：接种量5%,装液量为60%,采用适宜的溶氧(溶氧浓度15-25%),适宜的pH值(pH值在6.0-7.5),并采用间歇流加补料的工艺,可大大提高酶的发酵活力,优化后的发酵液酶活达到了890 U／mL,比未优化时630 U／mL提高1.4倍。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
1 前言  10-21
  1.1 淀粉酶概述  10-14
    1.1.1 淀粉酶的分类  10
    1.1.2 α-淀粉酶的性质  10-12
    1.1.3 α-淀粉酶的来源与生产  12
    1.1.4 α-淀粉酶蛋白质序列分析  12
    1.1.5 α-淀粉酶的立体构造  12-13
    1.1.6 α-淀粉酶的反应中心  13-14
  1.2 中温α-淀粉酶应用进展  14-17
    1.2.1 中温α-淀粉酶的应用  14-16
    1.2.2 中温α-淀粉酶的研究概况  16-17
  1.3 枯草芽孢杆菌表达系统  17-19
    1.3.1 草芽孢杆菌表达系统的特点  17-18
    1.3.2 转基因方法  18
    1.3.3 芽孢杆菌常用的宿主和载体  18-19
  1.4 本论文的研究意义及内容  19-21
    1.4.1 研究意义  19-20
    1.4.2 研究内容  20-21
2 材料与方法  21-38
  2.1 材料  21-26
    2.1.1 菌种及质粒  21
    2.1.2 主要药品  21-22
    2.1.3 工具酶及标准蛋白  22-23
    2.1.4 抗生素  23
    2.1.5 主要仪器  23-24
    2.1.6 相关溶液  24-26
    2.1.7 培养基  26
  2.2 实验方法  26-38
    2.2.1 培养条件  26-27
    2.2.2 菌体保存  27
    2.2.3 枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶活力测定方法  27-28
    2.2.4 枯草芽孢杆菌中质粒的提取  28
    2.2.5 枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取  28-29
    2.2.6 DNA溶液中蛋白质及RNA的去除  29
    2.2.7 DNA沉淀与贮存  29
    2.2.8 DNA纯度和浓度的测定  29-30
    2.2.9 聚合酶链式反应(PCR)  30-31
    2.2.10 DNA的酶切  31
    2.2.11 琼脂糖凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  31-32
    2.2.12 DNA片段的回收  32-33
    2.2.13 DNA连接  33
    2.2.14 质粒DNA对大肠杆菌的转化  33-34
    2.2.15 质粒DNA对枯草芽孢杆菌的转化  34
    2.2.16 基因测序  34-35
    2.2.17 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  35-36
    2.2.18 重组酶性质的研究  36
    2.2.19 菌体核酸量的测定  36
    2.2.20 总糖的测定方法  36-37
    2.2.21 正交试验设计及统计方法  37-38
3 结果与讨论  38-67
  3.1 出发菌株的生理及生产特性  38-40
    3.1.1 出发菌株的生理特性  38
    3.1.2 生长曲线的测定  38
    3.1.3 菌种产酶能力的测定  38-39
    3.1.4 酶作用最适温度的测定  39-40
    3.1.5 酶作用最适pH值的测定  40
  3.2 目的基因的制备  40-42
    3.2.1 质粒pET-22b的提取  40-41
    3.2.2 PCR扩增  41-42
  3.3 重组质粒pET-amy的构建及转化  42-45
    3.3.1 重组质粒pET-amy的构建  42-43
    3.3.2 转化大肠杆菌DH5α  43-44
    3.3.3 重组子的筛选和鉴定  44-45
  3.4 目的基因的序列测定  45-46
  3.5 表达载体pWB-amy的构建  46-49
    3.5.1 载体pWB980的特性  46
    3.5.2 表达载体pWB-amy的构建  46-47
    3.5.3 表达载体pWB-amy转化大肠杆菌WB600  47
    3.5.4 重组子的筛选和鉴定  47-49
  3.6 AMY的表达  49-50
  3.7 AMY的酶活检测  50
  3.8 重组酶性质的研究  50-52
    3.8.1 酶的最适温度  50-51
    3.8.2 酶的最适pH  51-52
  3.9 产酶培养基的优化  52-57
    3.9.1 不同碳源对产酶的影响  52-53
    3.9.2 碳源浓度对产酶的影响  53
    3.9.3 不同氮源对产酶的影响  53-54
    3.9.4 氮源浓度对产酶的影响  54
    3.9.5 不同金属盐对产酶的影响  54-55
    3.9.6 最佳产酶培养基的确定  55-57
  3.10 摇瓶产酶工艺参数的优化  57-61
    3.10.1 种子生长曲线的测定  57-58
    3.10.2 种龄对产酶的影响  58
    3.10.3 接种量对产酶的影响  58-59
    3.10.4 装液量对产酶的影响  59
    3.10.5 摇床转速对产酶的影响  59-60
    3.10.6 起始pH对产酶的影响  60-61
    3.10.7 摇瓶发酵过程曲线  61
  3.11 7L发酵罐产酶条件的研究  61-66
    3.11.1 发酵过程中溶氧浓度(D0值)的调控对产酶的影响  61-63
    3.11.2 发酵过程中pH值的变化及控制产酶的影响  63
    3.11.3 补料控制对产酶的影响  63-65
    3.11.4 7L发酵罐发酵过程曲线  65-66
  3.12 小结  66-67
4 结论  67-68
5 展望  68-69
6 参考文献  69-75
7 论文发表情况  75
8 申请专利  75-76
9 致谢  76

中温α-淀粉酶基因的异源表达及发酵条件的优化

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