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人血管性血友病因子A1A2A3功能区三联体在大肠杆菌和CHO细胞中表达及功能研究

作　者: 张婷婷
导　师: 阮长耿；赵益明
学　校: 苏州大学
专　业: 内科血液学
关键词: vWF A1A2A3区原核真核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血管性血友病因子(vWF)是有黏附特性的超大分子量的多聚体蛋白,由内皮细胞和巨核细胞／血小板合成,这种有着独特分子结构的蛋白在止血与血栓形成过程中起着重要的作用,而一旦VWF的质或量的改变,就发生血管性血友病(VWD)。血浆vWF以多种形式参与止血过程,可与血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa结合,还可与内皮下暴露的胶原结合,促使血小板在损伤的部位黏附,加速血小板的聚集,形成血小板血栓,在初期止血中起着重要的作用。但血浆中超大分子量vWF多聚体增多,可引起全身或局部血栓栓塞,导致血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发生。本文主要根据胶原-vWF-GPⅠb相互作用的关系,针对vWFA1、A2、A3功能区进行研究。以人全长vWF cDNA为模板,应用基因重组技术克隆了vWFA1A2A3功能结构域的基因片段,并在原核和真核细胞中表达,观察并比较了两种重组蛋白的生物学功能。目的：vWF-A1区含有血小板糖蛋白(GP)Ⅰba、瑞斯脱霉素(ristocetin)、肝素、脂类和胶原的结合位点,是vWF发挥生物学功能的重要结构区域。vWF-A3区是胶原纤维Ⅰ和Ⅲ型的结合部位。vWF-A2区含有血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13,也称vWF-CP)的裂解位点。本研究分别构建了人血管性血友病因子A1A2A3区(VWF-A1A2A3)编码序列基因原核及真核表达载体,并分别在大肠杆菌和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞中表达,为探讨VWF-A1A2A3的生物学功能奠定基础。方法：我们根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从vWF cDNA中扩增出人VWF-A1A2A3编码序列基因片段(rvWF-A1A2A3),测序正确后用限制性内切酶将目的片段分别插入PET-21b和pSectag2b载体中。采用酶切和PCR鉴定后,分别通过CaCl2转染至大肠杆菌和脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达。用Ni-NTA agarose柱纯化表达产物后,western blot生化鉴定目的蛋白。ELISA做胶原结合试验和ristocetin诱导下的血小板结合实验研究重组蛋白的生物学功能。并在在尿素变性的条件下用ADAMTS-13对重组蛋白进行切割后做western blot鉴定。结果：应用RT-PCR方法以人全长vWF cDNA为模板获得了VWF-A1A2A3的编码基因。测序证明克隆的基因序列完全正确,然后分别构建了表达载体pET-21b-vWF-A1A2A3以及pSectag2b-VWF-A1A2A3后,分别在大肠杆菌和CHO进行表达。原核表达的rvWF-A1A2A3经次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA agarose)柱纯化后,目的蛋白的纯度均在95%以上。将纯化的重组目的蛋白通过透析复性后进行了生物学功能的研究。真核表达无血清培养的优势在于无需进行蛋白的变性及复性过程,最大程度地保留了重组蛋白原有的空间结构。实验结果显示,重组vWF-A1A2A3 (rvWF-AlA2A3)蛋白具有良好的免疫学及生物学活性。rvWF-A1A2A3能够特异性的与抗His抗体、SZ-34、SZ-123、SZ-125和SZ-129单抗结合,western blot显示为单一的特异性的条带。应用ELISA做胶原结合试验和ristocetin诱导下的血小板结合实验,检测并比较大肠杆菌中高效表达的与真核表达的rvWF-AlA2A3的生物学活性。两种重组蛋白与人Ⅲ型胶原、血小板均有结合活性,但原核与真核两者间的结合能力有显著差异,S=10.5,P=0.0313,p<0.05,真核与Ⅲ型胶原及血小板的结合率较原核高。真核表达的rvWF-A1A2A3蛋白在含尿素、Ca2+/Zn2+缓冲液中能被ADAMTS-13切割成两个条带,且能与抗vWF多抗结合。结论：rvWF-A1A2A3功能区三联体在大肠杆菌和CHO细胞中成功表达,rvWF-A1A2A3蛋白具有良好的免疫学及生物学功能活性,为研究vWF相关的生物学结构、功能和临床应用奠定基础。

人血管性血友病因子A1A2A3功能区三联体在大肠杆菌和CHO细胞中表达及功能研究

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