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基于蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）和α-葡萄糖苷酶（GAA）的降糖筛选平台的建立及其应用

作　者: 刘禾培
导　师: 马纪；窦君
学　校: 新疆大学
专　业: 分子生物学
关键词: 糖尿病蛋白质酪氨酸磷酸1B α-葡萄糖苷酶原核表达筛选平台
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

[背景及目的]糖尿病是一种常见的代谢性疾病,它是由于胰岛素绝对或相对分泌不足所造成的,病理表现为身体内的糖、蛋白质、脂肪和电解质代谢紊乱。它可以涉及全身各个系统,甚至诱发许多致命性并发症,严重影响和危害人类健康。近年来,随着世界各国社会经济的发展、居民生活水平的提高和生活模式的改变,糖尿病的发病率及患病率逐年升高。在中国已确诊的糖尿病患者达4000万,已成为一种常见病、多发病。糖尿病主要有两种类型:1型糖尿病(type 1 diabetes),多与遗传背景相关。主要发生于青少年,其胰岛素分泌缺乏,必须注射治疗,但5年内一般没有并发症的发生。2型糖尿病(type 2 diabetes)是由于遗传与环境因素的共同作用造成的,其占糖尿病总数的90%以上。多见于中、老年人,其胰岛素的分泌量并不低甚至还偏高,病因主要是机体对胰岛素不敏感。2型糖尿病很容易引起慢性并发症如糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变等,这些都导致了糖尿病患者的高致残率和致死率。近年来的研究发现,这些慢性并发症的发生主要是与代谢中的一系列酶类异常调控有关。因此研究这些酶类的抑制剂或许有助于减少并发症的发生,降低并发症的危害,从而达到治疗糖尿病的目的。其中研究最多的酶类有:α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,GAA)、醛糖还原酶(aldose reductase ,AR)、二肽基肽(dipeptidyl peptidase, DPP),蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein-Tyrosine Phosphatase ,PTP)等。蛋白酪氨酸磷酸酶家族通过特异性地去除蛋白质中酪氨酸残基上的磷酸基团,来改变酪氨酸的磷酸化状态,从而行使对多种细胞功能的重要调节作用。其中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是胰岛素信号转导途径的负调控因子,可以降低胰岛素受体自身磷酸化水平,从而降低身体对胰岛素的敏感性。在PTP1B基因敲除的小鼠骨骼肌和肝脏中,其缺失可使胰岛素受体自身磷酸化水平提高,增加细胞或组织对胰岛素的敏感性。PTP1B负调控瘦素信号通路,表达增加和异常激活可引起信号传递紊乱。它在肝脏的过量表达可使超低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein ,VLDL)过量产生,引起脂代谢紊乱。糖、脂的代谢紊乱会进一步促进或加重了糖尿病慢性并发症的发生、发展。因此研究PTP1B的特异性抑制剂有望为治疗糖尿病的治疗提供新的帮助。然而,目前PTP1B的抑制剂种类和数量都较少,实验中常用的是对-硝基苯磷酸二钠(PNPP)。PNPP是人工化学合成的产品,在实践中发现存在价格高昂、对身体有一定毒副作用等问题,不是治疗糖尿病的最佳选择。为此需要从一些传统治疗糖尿病的药物和可食用植物中获取天然组分,从中筛选对PTP1B具有较强抑制作用的组分。这些组分纯天然,无毒副作用,对其深入研究有望为糖尿病的新药开发提供基础。维吾尔医药历史悠久,在其形成和发展过程中,采阿拉伯、中医药学之所长,是我国民族医药的独立分支,对人们的健康生活做出了重要贡献。据调查新疆全区有维药600余种,较常用的360种左右,主要有:巴旦杏、鹰嘴豆、雪莲花、沙生蜡菊等。在糖尿病的治疗过程中,传统维药中的一些药材具有很好的作用。近年来对这些药材进行深入研究,发现了多种治疗糖尿病及并发症的有效组分。所取得的成果为治疗糖尿病药物的开发,以及维吾尔医药的现代化发展提供了科学依据。[方法]利用分离纯化技术,从对糖尿病及其并发症有治疗作用的维药药材中提取有效组分。样品经冷冻干燥后,根据其极性的不同,用二甲基亚砜(DMSO)或蒸馏水配制成溶液备用。利用PCR技术,从真核表达载体pJ3H-PTP1B中扩增出蛋白酪氨酸磷酸酶1B的功能区域(PTP1B1-321)的编码序列,构建到原核表达载体pET-30a(+),pET-30a-PTP1B1-321通过DNA测序和双酶切鉴定。把重组质粒转入BL21(DE3)菌种中,诱导表达和纯化,得到目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定其大小。利用纯化的蛋白进行酶促动力学实验。从各种提取组分中,筛选对PTP1B抑制效果较好的组分,并测定其半抑制率(IC50)和抑制类型。把筛选出的组分加入正常培养的CHO细胞中,利用Western blot方法测定细胞中胰岛素信号通路下游因子AKT的磷酸化水平,应用氧化酶法测定细胞培养液中葡萄糖的含量。利用RT-PCR技术,克隆白色念珠菌的α-葡萄糖苷酶基因,构建到原核表达载体pET-30a-PTP1B1-321。通过DNA测序和双酶切鉴定。把重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌种中,诱导表达和纯化,得到目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定其大小,测定α-葡萄糖苷酶的最适pH值和作用底物。[结果](1)通过PCR获得了蛋白酪氨酸磷酸酶1B的功能区域PTP1B1-321,构建到原核表达载体上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为40.8 kDa。(2)通过酶促动力学实验,共检测了84份提取物。在500μg/mL的浓度下,筛选出了29个对PTP1B的抑制率在80 %以上的组分。测定了14个组分的IC50值,以及6个组分的抑制类型。(3)玫瑰花提取物明显增强AKT磷酸化,且AKT磷酸化水平随着PRRE浓度的增加而上升;培养液中葡萄糖的含量随PRRE浓度的增加而降低。(4)克隆了α-葡萄糖苷酶基因,构建到表达载体上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为41 kDa。经Ni2+亲和柱纯化的重组α-葡萄糖苷酶最适pH值为6.0,最适作用底物为hydrolyzeρ-nitrophenyl glucoside (pNPG),其次为可溶性淀粉和蔗糖。[结论]成功建立了靶向PTP1B和GAA的抗糖尿病筛选平台,并对维药提取物进行筛查,得到29个高活性的组分;初步阐明了PRRE抗糖尿病的分子机制:通过抑制PTP1B活性,上调胰岛素信号通路的下游因子AKT的激活,促进葡萄糖的转运,从而达到降糖的目的;本平台的建立为深入研究维药抗糖尿病的物质基础及分子机制提供技术支撑,并将有利于促进维药现代化。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
文献综述蛋白质酪氨酸磷酸酶 1B 及其抑制剂的研究进展  12-21
论文正文  21-52
  第一部分基于 PTP1B 降糖筛选模型的建立  21-28
    材料与方法  21-24
    结果  24-25
    讨论  25-26
    参考文献  26-28
  第二部分基于 PTP1B 的降糖筛选模型在维药中的应用  28-39
    材料与方法  28-29
    结果  29-37
    讨论  37-38
    参考文献  38-39
  第三部分 PRRE 降糖机制的研究  39-45
    材料与方法  39-40
    结果  40-42
    讨论  42-43
    参考文献  43-45
  第四部分基于GAA的降糖筛选模型的建立  45-52
    材料与方法  45-47
    结果  47-49
    讨论  49-50
    参考文献  50-52
结论与展望  52-53
附录  53-58
  附录1 硕士期间参加的研究课题和发表论文  53-54
  附录2 英文缩略语  54-55
  附录3 常用试剂配制方法  55-56
  附录4 主要设备与型号  56-57
  附录5 个人简历  57-58
致谢  58

基于蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）和α-葡萄糖苷酶（GAA）的降糖筛选平台的建立及其应用

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