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抗新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的研制及特性研究

作　者: 薛敏
导　师: 秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒核衣壳蛋白原核表达单克隆抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease, ND )是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV )引起的一种极易传染的烈性传染病,自1926年发现并分离到病毒,新城疫至今还在世界范围内发生、流行,对养禽业造成严重危害。新城疫病毒核衣壳蛋白是组成核衣壳最主要的结构蛋白,也可能是刺激机体产生细胞免疫反应的成分。NP蛋白的主要功能是与P(磷蛋白)和L(大蛋白)结合包裹基因组RNA形成一个螺旋的核糖核蛋白(RNP)复合体,在基因组RNA转录和复制的过程中起着非常重要的作用。本研究以NDV F48E8株为研究对象,以Genbank公布的NDV SRZ03株基因序列(登陆号:EU167540)为模板,设计一对引物,用RT-PCR方法对NP基因进行了克隆,经序列测定和分析正确后,进行了原核表达,制备了针对NP蛋白的单克隆抗体,为新城疫病毒的深入研究及临床检验提供了新材料。一、新城疫病毒NP基因的克隆及序列分析利用德国AXYGEN公司的总RNA小量提取试剂盒提取NDV F48E8株的RNA,根据Genbank公布的NDV SRZ03株基因序列(登陆号:EU167540),设计一对特异性引物,用RT-PCR的方法成功扩增出了NDV F48E8株的NP基因,并将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中。利用DNAstar5.0进行核苷酸序列分析表明,目的基因核苷酸序列长为1470bp;该序列与NDV其他代表毒株的NP基因序列比较分析结果显示,与其他强毒株的核苷酸同源性为77.4%~99.8%,氨基酸同源性为91.2%~99.2%;与中等毒株的核苷酸同源性为87.3%,氨基酸同源性为93.9%;与弱毒株的核苷酸同源性为84.9%~86.6%,氨基酸同源性为90.2%~93.5%。二、NDV NP蛋白的可溶性表达、纯化及应用将NP基因片段经EcoR I和Xho I双酶切从pGEM-T-NP重组载体上切下,连接至pGEX-6P-1表达载体中,经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性重组质粒转化到E.coli BL21感受态细胞中,筛选重组菌pGEX-6p-1-NP/BL21,用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得的融合蛋白主要以包涵体的形式出现,分子量约为79kDa,大小与预期相一致。为了获得可溶性表达的NP蛋白,以结核杆菌的CFP10基因插入pGEX-6p-1-NP重组质粒,构建CFP10-NP-GST融合表达质粒,经酶切鉴定后,阳性克隆进行序列测定。将含有CFP10基因的阳性重组质粒转化转化E.coli BL21感受态细胞,筛选重组菌pGEX-6p-1-CFP10-NP/BL21,分别以不同浓度的IPTG进行诱导,并设25℃、28℃、37℃三个温度梯度诱导,通过SDS-PAGE和Western-blot进行表达产物分析。结果表明IPTG终浓度为0.75mmol/L在28℃下诱导5h达到表达高峰,融合蛋白为可溶性表达,分子量约为89kDa,大小与预期相一致。融合蛋白免疫小鼠后,采取血清,间接免疫荧光检测后显示NP融合蛋白具有良好的抗原特异性。将诱导表达的可溶性融合蛋白经GST-琼脂糖凝胶柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示成功获得纯化的NP重组蛋白。利用该纯化NP蛋白建立新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法,并与HI及中和试验进行抗体相关性分析,结果显示间接ELISA与HI方法存在一定的相关性,但二者与中和作用的相关性不大。三、抗NDV NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究通过NDV全病毒及原核表达的重组NP蛋白两种不同的免疫原分别免疫BALB/C小鼠。免疫五次,最后一次免疫后72h内取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合后的杂交瘤分别采用间接ELISA及间接免疫荧光两种体系筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,结果共获得7株能稳定分泌抗NDV NP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为NDV-NP-2G4、NDV-NP-2E9、NDV-NP-1F8、NDV-NP-1E9、NDV-NP-4G9、NDV-NP-5B9、NDV-NP-6F5。亚类鉴定结果显示, NDV-NP-6F5亚类为IgG2a,其余均属于IgM。特异性鉴定结果表明,这些所有单抗与MDV、ALV、IBDV、FAV无交叉反应,仅与NDV病毒反应,显示它们具有良好的特异性。Western-blot分析结果进一步证实所获单抗是针对病毒的核衣壳蛋白。进一步用这些单抗对感染不同来源NDV细胞进行免疫荧光分析,结果表明6株单抗对不同来源的NDV NP蛋白均有不同程度的IFA反应。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
符号说明  9-10
文献综述  10-29
  1 NDV 的基本特性  10-13
  2 NDV 的分子生物学研究进展  13-19
  3 NDV 致病的分子基础  19-20
  4 新城疫诊断技术研究进展  20-23
  5 NDV 的历史流行状况  23-24
  6 小结与展望  24
  参考文献  24-29
第一章：NDV NP 基因的克隆及序列分析  29-41
  1、材料与方法  29-33
  2、结果  33-38
  3、讨论  38-39
  参考文献  39-41
第二章：NDV NP 蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及应用  41-64
  1、材料与方法  41-50
  2、结果  50-60
  3、讨论  60-62
  参考文献  62-64
第三章：抗NDV NP 蛋白单克隆抗体的研制及鉴定  64-78
  1、材料  64-65
  2、方法  65-68
  3、结果  68-75
  4、讨论  75-76
  参考文献  76-78
致谢  78

抗新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的研制及特性研究

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