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ECSCR通过TGFβ1信号通路抑制肝细胞癌生长和侵袭转移的研究

作　者: 李雪冬
导　师: 杨连粤
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: ECSCR 肝细胞癌 侵袭转移 细胞增殖 TGFβ1 预后
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全球最为常见的恶性肿瘤之一,具有预后恶劣、死亡率高等特点,是全球第三大癌症死因,严重威胁着我国人民的生命与健康。综观肝癌治疗现状,其术后复发转移率仍居高不下,已严重制约肝癌患者长期生存率的提高。因此,深入开展肝癌侵袭转移的研究将有助于探索新的肝癌干预治疗措施,进一步提高肝癌的治疗水平。内皮细胞特异性趋化调节因子(endothelial cell-specific chemotaxis regulator, ECSCR)是近年来新发现的一个单程跨膜蛋白,广泛表达于哺乳动物的内皮细胞和血管。已有研究表明,ECSCR能够促进细胞凋亡,增强细胞粘附,抑制细胞迁移等。因而我们推测ECSCR可能在肝癌的侵袭转移过程中通过调控肝癌细胞的凋亡和迁移运动发挥重要作用。研究目的研究人肝癌中ECSCR的表达情况,探讨其与肝癌临床病理特征和预后的关系；通过体内外实验进一步研究ECSCR在肝癌中的生物学作用及其作用机制。方法和结果1、ECSCR在肝癌组织及肝癌细胞系中均呈显著低表达。首先我们采用Real-time PCR、RT-PCR和Western-blot检测了肝癌组织及其相应的邻近非瘤肝组织中ECSCR的表达。结果显示,与邻近非瘤肝组织相比,ECSCR mRNA在肝癌组织中的相对表达水平的中位值为0.2912(以邻近非瘤肝组织中ECSCR mRNA的表达水平为1),且ECSCR mRNA(0.271±0.064vs.1.271±0.153, P<0.05)和蛋白(0.234±0.047vs.1.097±0.196, P<0.05)均在肝癌组织中呈显著性低表达。同时我们采用Real-time PCR及Western-blot检测了正常肝细胞系L02及HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L和HCCLM3等肝癌细胞系中ECSCR的表达。结果显示ECSCR在L02中的表达显著高于其他肝癌细胞系(P<0.05)。2、ECSCR低表达与肝癌临床病理特征及预后密切相关。我们采用免疫组化法检测了97例肝癌组织中ECSCR的表达,结果显示肝癌组织中ECSCR蛋白阳性表达率明显低于邻近非瘤肝组织(59.8%vs.100.0%,P<0.001),且其表达水平与肝癌大小(P=0.036)、结节数(P<0.001)、包膜或假包膜(P=0.001)、静脉侵犯(P=0.001)、巴塞罗那分期;P=0.002).TNM分期(P<0.001)及肝癌临床分型(P=0.001)等临床病理特征密切相关。同时,ECSCR (?)低表达组的无瘤生存时间(22.5±3.4vs.41.2±3.6月,P=0.002)及总体生存时间(31.1±4.6vs.49.0±3.2月,P=0.005)均明显短于ECSCR高表达组。多因素Cox比例风险回归分析显示,ECSCR低表达(HR=2.183,P=0.040)与静脉侵犯(HR=3.054,P=0.015)、包膜或假包膜(HR=4.239,P=0.004)、巴塞罗那分期(HR=2.469, P=0.046)、TNM分期(HR=2.768,P=0.014)及肝癌临床分型(HR=2.368,P=0.038)等是影响肝癌患者预后的独立危险因素,提示ECSCR的低表达预示肝癌患者不良预后。3、ECSCR在体外能抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力。我们通过慢病毒转染技术,构建了稳定过表达ECSCR的SMMC-7721ECSCR和HCCLM3ECSCR细胞系,以及对照组SMMC-7721Control和HCCLM3Control细胞系。体外功能学实验结果显示,ECSCR过表达组SMMC-7721ECSCR和HCCLM3ECSCR细胞的增殖速度分别明显低于相应的对照组SMMC-7721Control和HCCLM3Control细胞(P<0.01),集落形成数也分别明显低于相应对照组(109±22vs.480±37, P<0.01;80±12vs.255±17, P<0.01);而且ECSCR过表达组的划痕愈合率也分别明显低于相应对照组(47%vs.96%, P<0.001;27%vs.86%, P<0.001); Transwell实验结果显示,ECSCR过表达组细胞的侵袭能力较相应对照组也明显下降(33±8vs.134±11, P<0.001;12±4vs.56±7, P<0.001)。4、ECSCR通过抑制TGFβ1信号通路调控肝癌细胞的增殖和侵袭运动。我们首先采用肿瘤常见信号通路筛选试剂盒对ECSCR过表达组和对照组细胞中信号通路的表达活性进行筛选,结果显示ECSCR过表达组细胞中TGFP信号通路的表达活性明显下调(P<0.01)。继而我们采用Western-blot进一步检测TGFβ信号通路相关蛋白的表达,结果显示过表达组细胞中TGFβ1(0.154±0.024vs.1.014±0.127, P<0.05)、p-ERK(0.479±0.093vs.2.118±0.406, P<0.05)和p-Smad2/3蛋白(0.249±0.048vs.1.471±0.215,P<0.05)的表达水平均明显下调,而ERK(0.977±0.208vs.1.012±0.241, P=0.836)和Smad2/3蛋白(1.053±0.312vs.0.979±0.283,P=0.903)的表达水平无明显改变。细胞骨架免疫荧光染色的结果显示,对照组细胞的形态舒展、多样,伸出大量伪足；而ECSCR过表达组细胞的形态挛缩。5、ECSCR在体内能够抑制肝癌细胞的增殖和转移。我们建立了HCCLM3人肝癌细胞系裸鼠原位肝癌转移模型。结果显示,HCCLM3ECSCR组裸鼠的皮下瘤体积明显小于HCCLM3Control组(0.24±0.15vs.0.72±0.39cm3,P<0.05),且其肝内转移率(33.3%vs.83.3%,P<0.05)和肺转移率(16.7%vs.66.7%,P<0.05)均明显低于对照组。结论本研究首次发现ECSCR在人肝癌组织和肝癌细胞系中均呈显著低表达,且其表达水平与肝癌临床病理特征和预后密切相关。上调ECSCR的表达可在体内外显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭转移能力,其作用是通过调控TGFβ1信号通路来实现的。本研究结果提示ECSCR是一个潜在的肝癌干预治疗靶点和预后标志物。

全文目录


摘要  5-9
Abstract  9-14
目录  14-16
英文縮写词对照表  16-21
前言  21-23
材料与方法  23-40
  1. 肝细胞癌组织标本的收集  23-24
    1.1 新鲜组织标本的收集  23
    1.2 石蜡组织标本的收集  23-24
  2. 临床病理学研究  24
  3. 临床随访研究  24-25
  4. 半定量RT-PCR和荧光实时定量Real-time PCR  25-28
    4.1 组织总RNA的提取  25
    4.2 细胞总RNA的提取  25-26
    4.3 RNA的定量及质量检测  26
    4.4 逆转录反应(Reverse Transcription,RT)  26
    4.5 半定量RT-PCR反应  26-27
    4.6 荧光实时定量Real-time PCR反应  27-28
  5. 蛋白质免疫印迹(Western-blot)  28-30
    5.1 组织总蛋白的提取  28
    5.2 细胞总蛋白的提取  28-29
    5.3 总蛋白质浓度测定  29
    5.4 SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹  29-30
  6. 免疫组织化学研究  30-32
  7. 细胞培养  32-33
    7.1 细胞系和细胞培养环境  32
    7.2 细胞的复苏  32
    7.3 细胞的传代  32-33
    7.4 细胞的冻存  33
  8. 细胞转染  33-34
  9. 免疫荧光实验  34-35
    9.1 组织免疫荧光  34
    9.2 细胞免疫荧光  34-35
    9.3 细胞骨架免疫荧光染色  35
  10. 体外细胞学实验  35-37
    10.1 绘制细胞生长曲线  35-36
    10.2 集落形成实验  36
    10.3 划痕愈合实验(Wound-Healing Assay)  36
    10.4 Transwell侵袭小室实验(Transwell Assay)  36-37
  11. 肿瘤信号通路筛选  37-38
  12. 体内实验  38
    12.1 裸鼠皮下成瘤实验  38
    12.2 裸鼠肝脏被膜下原位移植瘤实验  38
  13. 统计学分析方法  38-40
结果  40-59
  1. ECSCR mRNA和蛋白在肝癌组织与肝癌细胞系中均呈显著性低表达  40-41
  2. ECSCR低表达与肝癌临床病理特征密切相关  41
  3. ECSCR低表达与肝癌患者不良预后密切相关  41-42
  4. 过表达ECSCR在体外能显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力  42-44
  5. ECSCR通过抑制TGFβ1/Smad信号通路调控肝癌细胞的增殖和侵袭运动  44-45
  6. 过表达ECSCR可在体内抑制肝癌细胞的增殖和肝内及肺转移  45-59
讨论  59-64
结论  64-65
参考文献  65-72
综述  72-85
  参考文献  80-85
攻读学位期间主要的研究成果  85-86
致谢  86

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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