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siRNA介导BMPR-Ⅱ基因沉默对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响

作　者: 蔡升
导　师: 吴建兵
学　校:
专　业: 肿瘤学
关键词: 肝癌 RNA干扰 骨形态发生蛋白受体Ⅱ 增殖 侵袭
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景与目的：原发性肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近期研究发现骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)信号通路在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本研究采用RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)抑制骨形态发生蛋白受体Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor，BMPR-Ⅱ)表达，观察抑制效果及抑制BMPR-Ⅱ表达后对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响。方法：设计并化学合成针对BMPR-Ⅱ的3对小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，阳离子脂质体法瞬间转染HepG2细胞。采用离体培养肝癌HepG2细胞，并设正常对照组、空白对照组、阴性siRNA组及siRNA-BMPR-Ⅱ-a、siRNA-BMPR-Ⅱ-b、siRNA-BMPR-Ⅱ-c转染组。各组培养48h后，运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测HepG2细胞中BMPR-Ⅱ在mRNA和蛋白水平表达的变化，MTT比色法及Transwell侵袭实验检测转染后细胞增殖及侵袭能力的变化。结果：RT-PCR、Western blot显示3对特异性siRNA-BMPR-Ⅱ转染组转染48h后，其BMPR-Ⅱ的mRNA和蛋白表达与另三组比较受到明显抑制，以siRNA-BMPR-Ⅱ-a抑制效果最明显(0.70±0.06、0.45±0.10，P<0.05)。MTT比色法及Transwell侵袭实验显示，转染48h后，siRNA-BMPR-Ⅱ-a转染组HepG2细胞的生长及穿膜数(48.27%±0.76%、25.20±1.60,P<0.05)明显低于正常对照组(82.64%±0.67%、60.40±1.39)及阴性对照组(81.21%±0.80%、59.50±1.85)。结论：siRNA干扰介导BMPR-Ⅱ基因沉默可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖和侵袭能力，BMPR-Ⅱ可作为肝癌抗肿瘤治疗的新靶点。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
中英文缩略词  8-9
第1章 引言  9-12
第2章 材料  12-17
  2.1 实验细胞来源  12
  2.2 主要试剂  12-13
  2.3 主要实验设备  13-14
  2.4 主要试剂配制  14-17
第3章 方法  17-27
  3.1 HepG2 细胞培养  17-18
    3.1.1 细胞复苏  17
    3.1.2 细胞传代  17-18
    3.1.3 细胞冻存  18
  3.2 siRNA 的设计与合成  18
  3.3 实验分组  18-19
  3.4 HepG2 细胞的转染  19
  3.5 RT-PCR 检测转染后 BMPR-ⅡmRNA 水平的表达  19-22
    3.5.1 总 RNA 提取  19-20
    3.5.2 RNA 质量鉴定  20
    3.5.3 RNA 逆转录成 cDNA  20
    3.5.4 PCR 扩增  20-21
    3.5.5 电泳及琼脂糖凝胶分析  21-22
  3.6 Western blot 检测转染后 BMPR-Ⅱ蛋白水平的表达  22-25
    3.6.1 细胞总蛋白的提取  22
    3.6.2 SDS-PAGE 电泳  22-23
    3.6.3 转膜  23-24
    3.6.4 封闭  24
    3.6.5 免疫反应  24
    3.6.6 化学发光法，显影，定影  24
    3.6.7 凝胶图像分析  24-25
    3.6.8 通过 RT-PCR 及 Western blot 检测，筛选最佳 siRNA 干扰片段  25
  3.7 MTT 比色法检测 siRNA 抑制 BMPR-Ⅱ表达对各组 HepG2 细胞生长的抑制作用  25
  3.8 siRNA 抑制 BMPR-Ⅱ表达对各组 HepG2 细胞体外侵袭能力的影响（Transwell 实验）  25-26
  3.9 统计学分析  26-27
第4章 结果  27-32
  4.1 siRNA 转染 HepG2 细胞条件及荧光检测转染效率  27
  4.2 siRNA- BMPR-Ⅱ对 HepG2 细胞 BMPR-Ⅱ表达的影响  27-29
    4.2.1 半定量 RT-PCR 检测各组 BMPR-ⅡmRNA 的表达  27-28
    4.2.2 Western blot 检测各组 BMPR-Ⅱ蛋白的表达  28-29
  4.3 siRNA 抑制 BMPR-Ⅱ表达对 HepG2 细胞贴壁生长及细胞形态的影响  29
  4.4 MTT 比色法检测 siRNA 抑制 BMPR-Ⅱ表达对 HepG2 细胞生长的影响  29-30
  4.5 siRNA 抑制 BMPR-Ⅱ表达对 HepG2 细胞侵袭能力的影响  30-32
第5章 讨论  32-36
第6章 结论及展望  36-37
  6.1 结论  36
  6.2 展望  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-41
攻读学位期间的研究成果  41-42
综述  42-48
  参考文献  46-48

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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