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基于骨髓间充质干细胞对微环境的调控作用影响皮肤瘢痕形成的实验研究

作　者: 武艳
导　师: 付小兵
学　校: 南开大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 间充质干细胞瘢痕增生性瘢痕成纤维细胞微环境转化生长因子生物活性因子细胞治疗
分类号: R622
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

当皮肤受到较重损伤后,在受到各种内外源性致病原(氧自由基、病毒、细菌、粉尘等)刺激下,免疫系统被激活,发生炎症反应以抵抗外来损伤,或使其愈合过程减慢或发生不良的愈合结果(例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩),仍是临床亟待解决的难题之一。尽管目前促进创伤修复和抑制过度瘢痕形成的治疗方法有很多,但是,在促愈和瘢痕治疗之间还存在着一定的矛盾：如生长因子类促愈合治疗的同时具有加重瘢痕形成的风险。目前对于皮肤瘢痕的治疗方法有其局限性,治疗效果不好,有的副作用大甚至影响愈合。因此,寻求一种新的皮肤瘢痕治疗方法,既不会影响愈合的效果,又能抑制瘢痕的形成,这对于易形成瘢痕的烫伤、烧伤、严重外伤等创伤的治疗有着十分重要的意义。随着对干细胞认识的深入和相关技术的发展,为解决这一临床难题带来了希望。间充质干细胞(MSCs)是细胞疗法中重要的成员之一,具有来源广泛、取材方便、低免疫原性以及可自体移植等优势。目前已有研究证实MSCs可通过多种调节机制在创伤愈合过程中发挥其治疗作用,大多学者认为,MSCs在此过程中通过分泌各种生物活性因子而发挥作用。在动物实验和临床研究中发现,MSCs能够促进心肌梗死后心肌功能的修复,并且减少了瘢痕形成面积,对肺纤维化也有一定的治疗作用,这些均给纤维化性疾病的治疗带来了希望。但MSCs是否对于皮肤瘢痕的修复也起作用呢?是否也是通过分泌的生物活性因子起作用呢?至今尚无明确的研究报道。本研究通过建立体外和体内模拟瘢痕形成的微环境,研究骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)在此方面的作用,分两个部分进行如下研究：1.人骨髓间充质干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞影响的实验研究(1)全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞(HBM-MSCs),并进行鉴定扩增；(2)增生性瘢痕成纤维细胞的分离、培养、鉴定及扩增；(3)将制备的HBM-MSCs条件培养液作用于原代培养的增生性瘢痕成纤维细胞,观察对其增殖能力及胶原产生的影响；(4)筛选在HBM-MSCs抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原产生过程中的关键蛋白,初步探讨BM-MSCs抑制增生性瘢痕成纤维细胞的分子机制。2.骨髓间充质干细胞影响创面瘢痕形成作用的研究(1)采用博来霉素皮下局部注射的方法构建小鼠渐进性皮肤瘢痕动物模型：(2)分离、培养、鉴定、扩增绿色荧光(GFP)转基因小鼠的BM-MSCs。依托此自行构建的动物模型,示踪BM-MSCs在体内存活时间和分布,进一步探索MSCs在皮肤瘢痕形成中的作用。(3)初步探讨BM-MSCs在调控皮肤瘢痕形成的过程中的作用机制,评价其作为新型细胞疗法抑制瘢痕形成的可行性。主要结果与结论如下：1. HBM-MSCs的条件培养液作为刺激因子孵育瘢痕成纤维细胞,结果发现HBM-MSCs可抑制此细胞的增殖、分化,在基因和蛋白水平上的检测中发现HBM-MSCs可以抑制胶原的合成。2.筛选HBM-MSCs分泌成分中抗纤维化的生物活性因子,在筛选过程中确定转化生长因子(TGF)家族蛋白高表达,并且在炎症因子刺激下,TGF-β1和TGF-β3的分泌显著增强；3.将HBM-MSCs分泌的关键蛋白用相应抗体中和会降低HBM-MSCs对瘢痕成纤维细胞的抑制作用。4.采用GFP转基因小鼠的BM-MSCs移植入瘢痕模型体内,采用荧光示踪和tunel凋亡检测发现BM-MSCs在体内的作用时间很短,为24小时左右。5. BM-MSCs可以抑制小鼠渐进性皮肤瘢痕模型中瘢痕的形成,在瘢痕样本中对抗纤维化的关键蛋白检测发现,在动物模型中BM-MSCs可以直接分泌抗纤维化的蛋白发挥抑制瘢痕形成的作用。以上研究结果表明,MSCs可以分泌抗纤维化的生物活性因子,通过一系列的调节作用包括抑制炎性因子、成纤维细胞的增殖和分化、胶原的产生以及细胞外基质的沉积等,调节组织修复的微环境,在博来霉素诱导的小鼠渐进性皮肤瘢痕动物模型中抑制了瘢痕的进展,并且此种作用可能与MSCs调节TGF-β家族在瘢痕形成过程的作用密切相关,TGF-β3在此过程中有积极的调控作用,至少是部分作用。值得我们注意的是,尽管由BM-MSCs分泌的TGF-β3确实具有抗纤维化的作用,但绝不是在减轻皮肤纤维化、促进皮肤创伤修复过程唯一的活性因子,可能是BM-MSCs分泌的活性因子发挥的协同作用。最重要的是,本研究表明对于皮肤瘢痕形成干预性的治疗是有效的,但是这种作用是否存在普遍性和稳定性以及其具体的作用机制尚需进一步探讨,明确MSCs在皮肤瘢痕方面的作用机制,为其今后在临床上的应用推广提供基础理论和治疗策略,具有重大的科学意义。总之,BM-MSCs有促皮肤创伤愈合的作用,可通过分泌抗纤维化的生物活性因子调节成纤维细胞的增殖、抑制胶原的累积而产生抗纤维化的作用,抑制瘢痕产生。这一发现也为我们理解干细胞在皮肤创伤修复与愈合中的作用机制提供了一个新的视角,同时达到促进愈合和抑制瘢痕形成的效果,也为以细胞疗法为策略减轻瘢痕的方法提供了新的理论支持。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-15
前言  15-17
文献回顾  17-47
第一章实验仪器与材料  47-55
  一、主要实验仪器  47-48
  二、主要实验材料  48-51
  三、主要溶液配制  51-55
第二章人骨髓间充质干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞影响的实验研究  55-93
  第一节人骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定  55-66
    一、实验方法  55-59
    二、实验结果  59-63
    三、讨论  63-66
  第二节增生性瘢痕成纤维细胞分离、培养及鉴定  66-71
    一、实验方法  66-67
    二、实验结果  67-69
    三、讨论  69-71
  第三节人骨髓间充质干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力及胶原形成的调控作用  71-80
    一、实验方法  71-73
    二、实验结果  73-76
    三、讨论  76-80
  第四节人骨髓间充质干细胞分泌成分中关键蛋白的检测及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力及胶原形成的作用  80-93
    一、实验方法  80-83
    二、实验结果  83-89
    三、讨论  89-93
第三章骨髓间充质干细胞影响创面瘢痕形成的作用研究  93-120
  第一节小鼠渐进性皮肤瘢痕模型的制备  93-99
    一、实验方法  93-95
    二、实验结果  95-96
    三、讨论  96-99
  第二节骨髓间充质干细胞对瘢痕创面的促愈作用及影响瘢痕形成的实验观察  99-120
    一、实验方法  99-105
    二、实验结果  105-114
    三、讨论  114-120
第四章结论与展望  120-122
参考文献  122-146
英文综述  146-164
  REFERENCES  157-164
致谢  164-165
个人简历  165-166
在学期间发表的学术论文及研究成果  166
在学期间参加的学术会议  166
基金资助  166

基于骨髓间充质干细胞对微环境的调控作用影响皮肤瘢痕形成的实验研究

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