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重组人神经生长因子的克隆、表达、纯化、性质和其应用的研究

作　者: 王妍
导　师: 曹淑桂
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人神经生长因子神经细胞复性生物活性因子决定性作用工程菌营养作用神经修复感觉神经基因合成
分类号: Q789
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

人神经生长因子(hNGF)是在人体中发现的一种对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子,它可维持交感神经和感觉神经的生存,促进神经细胞的分化,决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育,神经系统的生长,损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。本文的研究工作主要是首先使用全基因合成的方法,选择E.coli偏爱的密码子,合成得到了的rhNGF cDNA。经序列测定,证实所获cDNA序列与文献报道的序列一致。将所获cDNA插入我们自己构建的表达载体pthioHisA,得到rhNGF工程菌。将该工程菌在LB培养基中表达,用IPTG诱导,经SDS—PAGE检测,rhNGF表达水平占菌体总蛋白的10-20%。因为rhNGF含有三对二硫键,复性十分困难,若用常规复性方法进行复性,复性率不超过15%。为了提高复性率,我们经深入研究,使用了用thioredoxin催化rhNGF复性的创新工艺,rhNGF以可溶的形式存在于菌体中。将产物分泌、切割、纯化,得到了天然活性的正确折叠的rhNGF,具有rhNGF的生物学活性。其纯化后的产物经性能分析,确定其为rhNGF。通过体内和体外的生物活性方法的建立和研究,并通过建立各种动物模型对rhNGF的药效学进行了研究,主要是治疗化学和机械损伤导致的周围神经病变以及缺氧缺血导致的神经病变和治疗老年痴呆病等动物实验研究,取得了相当有效的结果,为进一步开发rhNGF的临床应用提供依据,以上本文的工作为开发rhNGF和其产业化打下了坚实的基础。

全文目录

第一章绪论  13-51
  1.1 神经系统和神经性疾病  13-24
    1.1.1 神经活动基本过程  13-15
    1.1.2 神经系统的发育  15-19
    1.1.3 临床神经性疾病的种类特点和治疗的困惑  19-23
    1.1.4 神经性疾病治疗的方法和困惑  23-24
  1.2 神经生长因子  24-40
    1.2.1 NGF的发现史  24-26
    1.2.2 NGF的基因和分子结构  26-28
    1.2.3 NGF的分布  28-29
    1.2.4 NGF的多种生物学功能  29-40
  1.3 立题依据  40-42
  1.4 参考文献  42-51
第二章重组人神经生长因子的工程菌构建及其表达  51-74
  2.1 引言  51-52
  2.2 仪器与材料  52-56
    2.2.1 仪器  52-53
    2.2.2 实验材料  53
    2.2.3 溶液配制  53-56
  2.3 实验方法  56-66
    2.3.1 目的基因的合成和扩增  56-57
    2.3.2 PCR产物的酶切和纯化  57-58
    2.3.3 表达载体的构建  58-60
    2.3.4 目的基因与载体的连接  60-62
    2.3.5 工程菌的筛选和检定  62
    2.3.6 目的蛋白的表达和鉴定  62-66
  2.4 结果和讨论  66-71
    2.4.1 基因序列测定  66-67
    2.4.2 工程菌的形态和特性  67
    2.4.3 质粒酶切图谱分析  67-68
    2.4.4 表达的目的产物的特异性鉴别  68-69
    2.4.5 表达的目的产物N末端氨基酸序列分析  69-70
    2.4.6 表达的目的产物的氨基酸组成分析  70
    2.4.7 表达产物的SDS-PAGE结果  70-71
  2.5 小结  71-72
  2.6 参考文献  72-74
第三章重组人神经生长因子的发酵工艺研究  74-97
  3.1 引言  74-75
  3.2 仪器与材料  75-78
    3.2.1 主要仪器  75
    3.2.2 实验材料  75-76
    3.2.3 溶液的配制  76-78
  3.3 实验方法  78-82
    3.3.1 SDS-PAGE电泳方法  78
    3.3.2 种子液制备  78
    3.3.3 发酵过程  78-79
    3.3.4 发酵条件  79-80
    3.3.5 工程菌的传代稳定性  80
    3.3.6 接种量  80
    3.3.7 诱导时机、时间和诱导剂的浓度  80-81
    3.3.8 补料成分和速度  81
    3.3.9 葡萄糖和乳酸的测定  81
    3.3.10 发酵工艺的放大和发酵动力学  81-82
  3.4 结果和讨论  82-94
    3.4.1 工程菌的原始、主代和工作批的检定结果  82-84
    3.4.2 rhNGF工程菌在贮存复苏条件下的稳定性试验  84-85
    3.4.3 rhNGF工程菌用平板连续传代的稳定性  85-87
    3.4.4 rhNGF生产用种子库外源因子检查  87-88
    3.4.5 培养条件的确定  88-90
    3.4.6 诱导条件确定结果  90-92
    3.4.7 发酵动力学曲线分析  92-94
  3.5 小结  94-95
  3.6 参考文献  95-97
第四章重组人神经生长因子的纯化和理化性质的研究  97-124
  4.1 引言  97-98
  4.2 仪器与材料  98-100
    4.2.1 主要仪器  98
    4.2.2 实验材料  98-99
    4.2.3 溶液的配制  99-100
  4.3 实验方法  100-106
    4.3.1 粗提  100-101
    4.3.2 精提  101-103
    4.3.3 目的蛋白的纯度  103-104
    4.3.4 目的蛋白的特异性  104
    4.3.5 N端氨基酸序列分析  104
    4.3.6 目的蛋白的其它理化性质分析  104-105
    4.3.7 目的蛋白的相关结构分析  105-106
  4.4 结果和讨论  106-121
    4.4.1 各步纯化条件的确定  106-108
    4.4.2 主要纯化步骤的SDS-PAGE的结果分析  108-110
    4.4.3 各步纯化后蛋白纯度、收率  110-112
    4.4.4 目的蛋白的纯度分析  112-114
    4.4.5 目的蛋白的分子量和等电点  114-115
    4.4.6 目的蛋白其它的检定结果  115-119
    4.4.7 制剂的配方研究结果  119-121
  4.5 小结  121-123
  4.6 参考文献  123-124
第五章重组人神经生长因子体内及体外生物活性的研究  124-158
  5.1 引言  124
  5.2 仪器与材料  124-127
    5.2.1 主要仪器  124-125
    5.2.2 实验材料  125-126
    5.2.3 溶液配制  126-127
  5.3 实验方法  127-139
    5.3.1 MTT法  127-128
    5.3.2 鸡胚神经节法  128-131
    5.3.3 化学中毒造成大鼠中毒性周围神经病变  131-136
    5.3.4 家兔尺神经机械损伤小鼠周围神经病变法  136
    5.3.5 大鼠缺氧缺血性病变造模  136-137
    5.3.6 大鼠老年性痴呆模型的建立和给药方案  137-138
    5.3.7 rhNGF在小鼠体内的动力学、组织分布实验方法  138-139
  5.4 结果与讨论  139-154
    5.4.1 体外生物活性测定方法 MTT的结果  139-140
    5.4.2 体外生物活性测定方法鸡胚神经节的结果  140-143
    5.4.3 NGF治疗化学中毒性围神经病变结果  143-149
    5.4.4 rhNGF治疗新生大鼠缺氧性病变结果  149-151
    5.4.5 rhNGF治疗小鼠机械性损伤周围神经病变结果  151
    5.4.6 rhNGF延缓大鼠老年性痴呆的结果  151-152
    5.4.7 rhNGF药代动力学实验结果  152-154
  5.5 小结  154-155
  5.6 参考文献  155-158
附录  158-161
  作者简介  158
  博士期间工作  158-161
中文摘要  161-165
英文摘要  165-173
致谢  173

重组人神经生长因子的克隆、表达、纯化、性质和其应用的研究

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