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蟾蜍灵诱导人骨肉瘤细胞Saos-2和U-2os凋亡及其作用机制的研究

作　者: 沙婧婧
导　师: 姚阳
学　校: 苏州大学
专　业: 临床医学
关键词: miRNA-29a 蟾蜍灵骨肉瘤细胞凋亡
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：探讨蟾蜍灵(Bufalin)诱导人骨肉瘤细胞Saos-2和U-2os凋亡,抑制其体外增殖的机制,为临床骨肉瘤的综合治疗提供新的思路。方法：采用不同浓度的蟾蜍灵分别作用于人骨肉瘤Saos-2和U-2os细胞系,CCK8法检测细胞增殖抑制率,Hoechst33258染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡形态的改变,JC-1法检测用药前后细胞线粒体膜电位变化,2,7-双氢二氯荧光黄染色法检测细胞内活性氧(ROS)的水平。流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。Micro-array分析0.25umol/L蟾蜍灵作用前后Saos-2细胞microRNA表达谱差异。Real-Time PCR法检测在骨肉瘤细胞中表达异常的miRNA-29a的变化。Targetscan软件预测miR-29a靶标,荧光素酶活性实验验证miR-29a与其靶向蛋白BBC3(PUMA)的调控关系。Western Blotting法检测蟾蜍灵处理后骨肉瘤细胞中凋亡相关蛋白PUMA表达变化。结果：10nmol/L以上浓度的蟾蜍灵作用于人骨肉瘤细胞Saos-2和U-2os细胞抑制率在20%以上(p<0.05),且呈量效依赖性抑制肿瘤细胞增殖。蟾蜍灵作用Saos-2和U-2os细胞增殖24h的IC50分别为0.28±0.05umol/L和0.35±0.09umol/L。2,7-双氢二氯荧光黄染色法显示骨肉瘤细胞内活性氧水平随药物浓度增加而增多,细胞线粒体膜电位随药物浓度增加而逐渐减低,提示蟾蜍灵通过激活线粒体凋亡途径,诱导骨肉瘤细胞凋亡,抑制其增殖。蟾蜍灵(Bufalin)作用于骨肉瘤细胞后可引起miRNA-29a表达下调(p<0.05),且呈浓度依赖性。荧光素酶试验证实,miRNA-29a靶向负调控BBC3,后者随药物浓度升高而升高。细胞凋亡死亡率与之正相关,亦呈浓度依赖性。结论：蟾蜍灵通过抑制mi RNA-29a水平,上调其靶蛋白PUMA表达上调,增加细胞内活性氧激活线粒体凋亡途径,呈浓度依赖性诱导人骨肉瘤Saos-2和U-2os细胞凋亡,抑制其增殖。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
引言  9-12
实验材料  12-15
实验方法  15-32
实验流程图  32-33
实验结果  33-46
  1. 蟾蜍灵对人骨肉瘤细胞系Saos-2和U-2os增殖抑制作用  33-39
    1.1 Saos-2和U-2os细胞一般形态学观察  33-34
    1.2 CCK-8检测蟾蜍灵对骨肉瘤细胞的增殖抑制  34-35
    1.3 Hoechst33258染色观察细胞形态  35-36
    1.4 流式细胞术检测)周亡  36-37
    1.5 细胞内活性氧检测  37-38
    1.6 细胞线粒体膜电位检测  38-39
  2. 蟾蜍灵对人骨肉瘤细胞系Saos-2和U-2os增殖抑制作用机制  39-46
    2.1 蟾餘灵处理前后骨肉细胞瘤miRNA表达谱的改变  39-40
    2.2 QRT-PCR 检测 i RNA-29a 的表达  40-42
    2.3 Targestcan 分析 mi RNA 作用IS标  42-44
    2.4 焚光素酶试验  44
    2.5 Werstern Blot检测调亡相关蛋白的表达  44-46
讨论  46-50
结论  50-51
参考文献  51-54
附录  54-67
攻读硕士学位期间发表文章  67-68
致谢  68-69

蟾蜍灵诱导人骨肉瘤细胞Saos-2和U-2os凋亡及其作用机制的研究

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