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罗汉果的遗传毒性与胚胎发育毒性实验研究

作 者: 张宏
导 师: 李啸红
学 校: 遵义医学院
专 业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 罗汉果 遗传毒性 胚胎毒性 细胞凋亡 B细胞淋巴瘤/白血病-2 bcl-2相关X蛋白
分类号: R285.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


目的:探讨传统中药罗汉果遗传毒性和胚胎发育毒性,为罗汉果的食用及药用安全性提供实验依据。方法:1.急性毒性试验:最大耐受剂量法(Maximum tolerated dose, MTD)检测罗汉果对昆明小鼠和SD大鼠的经口急性毒性。2.遗传毒性试验:(1)雄性小鼠遗传毒性检测:①精子畸形试验:雄性昆明小鼠40只,随机分为5组,8只/组。高、中、低剂量组(罗汉果水煎液30 g/kg、15 g/kg、7.5 g/kg)和阴性对照组(蒸馏水,0.2 mL/20g)灌胃相应剂量受试物,阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CP40mg/kg),各组小鼠均连续用药5 d,1次/日。于首次给药后第35 d处死,取附睾制精子涂片,染色后,计数精子畸形率。②小鼠骨髓微核试验:昆明雄性小鼠40只,分组及用药剂量同上。罗汉果高、中、低剂量组和阴性对照组连续灌胃5 d,1次/日;阳性对照组于处死前1 d腹腔注射环磷酰胺,1次/日,连续2 d。于末次用药2 h后处死各组小鼠,取后肢股骨,制骨髓涂片,染色后计数骨髓中嗜多染红细胞微核率。(2)孕鼠及胚胎遗传毒性检测:小鼠孕鼠骨髓微核试验和胚胎肝转移微核试验:昆明小鼠孕鼠40只,分为5组,8只/组:罗汉果高、中、低剂量组(30g/kg、15g/kg、7.5g/kg)和阴性对照组(NS,0.2mL/20g)自孕12 d起连续灌胃5 d,1次/日。阳性对照组自孕15 d起腹腔注射环磷酰胺(CP 40mg/kg),1次/日,连续2 d。于孕16 d末次用药2 h后处死各组小鼠,制骨髓和胚胎肝细胞涂片,染色后计数孕鼠骨髓和胎鼠肝脏中嗜多染红细胞微核率。(3)单细胞凝胶电泳试验(SCEG):昆明小鼠40只,雌雄各半,分组及用药剂量同上。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CP 40 mg/kg·d)1次,高、中、低剂量组和阴性对照组连续灌胃4 d,各组于末次用药24 h后处死,单细胞凝胶电泳试验检查胸腺淋巴细胞DNA损伤情况。3.胚胎发育毒性试验:①致畸试验:SD孕鼠50只,分为5组,10只/组。阳性对照组于大鼠孕10 d时用维甲酸100 mg/kg灌胃一次;罗汉果高、中、低剂量组(罗汉果水煎液30 g/kg、15 g/kg、7.5 g/kg)和阴性对照组(蒸馏水,2.0 mL/200g)于孕6 d~18 d,分别灌胃相应剂量受试物,1次/日。各组孕鼠均于孕18 d灌胃2 h后麻醉处死,取卵巢、胚胎,记录活胎数、死胎数、吸收胎数。观察胚胎外观畸形发生情况,称量每只活胎鼠体重并测量其身长、尾长。称子宫重、卵巢重、胎盘重,计数黄体数。胚胎总数的一半用阿利新蓝和茜素红双染后观察胚胎骨骼发育情况,其它胚胎做成干重标本并称干重。②免疫组化方法检测胚胎鼠脊髓组织中bcl-2、bax蛋白的表达;③TUNEL法:荧光标记检测胚胎鼠脊髓组织细胞凋亡情况。结果:1.遗传毒性试验:①罗汉果水煎液灌胃昆明小鼠和SD大鼠的最大给药量均达到120 g/kg。②罗汉果水煎液30g/kg、15 g/kg、7.5 g/kg剂量组的小鼠胎肝微核率、孕鼠骨髓微核率、雄性小鼠骨髓微核率、精子畸形率与阴性对照组相比,均无显著性差异(P>0.05):彗星图像显示:各剂量罗汉果水煎液没有引起淋巴细胞的DNA电泳明显迁移,头部DNA100%、尾部DNA100%、尾长、尾矩、Olive矩等相关指标与阴性对照组相比,均无显著性差异(P>0.05)。2.胚胎发育毒性试验:①罗汉果水煎液30g/kg、15 g/kg、7.5 g/kg剂量组孕鼠的孕期增重、植入胚胎总数、吸收胎率、死胎率、畸胎率以及胚胎着床后丢失率与阴性对照组相比,均无显著性差异。胎盘重、胎鼠体重、身长、尾长、胚胎干重与阴性对照组相比,均无显著性差异。罗汉果水煎液各剂量组胚胎均无外观畸形发生,枕骨发育评分、胸骨节数、胸骨节的骨化数、四肢长骨的骨化长度与阴性对照组相比,均没有显著性差异(P>0.05)。②罗汉果水煎液30g/kg、15g/kg、7.5 g/kg剂量组胚胎脊髓组织bcl-2,bax蛋白表达的平均灰度值与阴性对照组相比,都没有显著性差异。罗汉果水煎液各剂量组胚胎脊髓组织细胞的凋亡指数与阴性对照组比较,无显著性差异。结论:1.罗汉果水煎液对昆明小鼠的经口急性毒性最大耐受剂量大于120 g/kg体重,罗汉果水煎液对SD大鼠的经口急性毒性最大耐受剂量大于120 g/kg体重。属无毒级。2.罗汉果水煎液各剂量组对成年小鼠与胎鼠均无遗传毒性。3.罗汉果水煎液对SD孕鼠没有毒性作用。4.罗汉果不影响骨骼的分化和骨化,对大鼠胚胎没有致畸作用,在器官水平上,罗汉果水煎液没有发育毒性。5.罗汉果水煎液各剂量组对大鼠胚胎脊髓组织的bcl-2, bax蛋白表达以及脊髓组织内凋亡的细胞数无影响,说明在细胞和分子水平,罗汉果没有影响胚胎的发育。6.通过对胚胎干重的统计分析,认为罗汉果没有影响胚胎DNA含量和蛋白质的表达。7.根据以上结论,认为罗汉果水煎液在30 g/kg时(相当于人体临床用量的100倍)对大鼠胚胎无致畸作用,也没有发育毒性。对小鼠及胚胎没有遗传毒性。

全文目录


英文缩略词  4-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-18
第一部分 罗汉果遗传毒性研究  18-33
  材料  18-21
  方法  21-26
  结果  26-29
  讨论  29-32
  结论  32-33
第二部分 罗汉果的胚胎发育毒性研究  33-53
  材料  33-36
  方法  36-43
  结果  43-48
  讨论  48-52
  结论  52-53
参考文献  53-58
附图  58-67
综述  67-75
  参考文献  71-75
致谢  75-77
作者简介  77-78

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