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缺氧促进MSCs成脂分化的机制研究

作　者: 江琛
导　师: 向娟娟
学　校: 中南大学
专　业: 遗传学
关键词: 缺氧 间充质干细胞 成脂分化
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell, MSCs)是肿瘤微环境的重要组成成分,对肿瘤侵袭和转移发挥重要的影响。同时肿瘤微环境对于间充质干细胞的分化和功能也产生重要的影响。两者之间构成复杂的调控网络。缺氧是肿瘤微环境的一个重要环境因素。本研究拟研究缺氧对MSCS的分化潜能的影响,并探寻参与作用的重要调控分子。[缺氧抑制MSCs成骨分化,促进MSCs成脂分化]MSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。我们将MSCs在0.2%O2的缺氧条件下分别使用诱导培基和普通培基处理人骨髓来源MSCs3天,应用碱性磷酸酶染色和油红O染色后观察细胞内成骨细胞标志性的酶以及脂滴形成积累情况,并用Real-time PCR法检测MSCs的成骨细胞和脂肪细胞标志分子的表达,结果表明在缺氧条件了MSCs的成骨分化潜能降低；成脂分化潜能增高。[缺氧MSCs成脂分化的调控网络构建]我们应用Real-time PCR芯片筛选缺氧条件下差异表达的MSCs成脂分化相关分子。筛选出10个上调分子,11个下调分子。我们把差异表达的分子构建了缺氧条件下的MSCs的成脂分化的调控网络。结果发现C/EBP家族和PPAR-γ处于调控网络的中心位置,调控多个成脂相关基因表达。[缺氧MSCs成脂分化相关调控因子的确定]我们进一步验证了在缺氧条件下MSCs的成脂分化关键转录因子PPAR-γ表达下调,转录因子C/EBPs表达明显增高。同时对MSCs使用PPAR-γ抑制剂或C/EBPs抑制剂后在缺氧条件下进行成脂分化实验,在细胞水平和分子水平检测MSCs的成脂分化水平,结果表明PPAR-γ的抑制剂不能抑制缺氧下MSCs的成脂分化。应用C/EBPs的抑制剂可以明显抑制缺氧条件下的MSCs的成脂分化潜能。因此我们认为在缺氧条件下,MSCs通过PPAR-γ非依赖性通路促进成脂分化。转录因子C/EBPs在缺氧MSCs成脂分化过程中发挥重要的作用。为了明确Hif-1α在缺氧环境下,对于MSCs的成脂分化潜能的影响,我们建立了Hif-1α的shRNA稳定表达MSC细胞株。Hif-1α表达封闭的MSCs在细胞水平上没有明显降低MSCs在缺氧下形成的脂滴数量,但是能降低部分成脂相关分子的表达。结果表明缺氧对于MSCs的成脂分化潜能的促进部分依赖于Hif-1α。C/EBPs抑制剂和Hif-1α封闭同时作用下,MSCs在缺氧下的成脂分化程度相较于单独使用C/EBPs抑制剂被更加强烈地抑制,提示Hif-1α和C/EBPs在缺氧下存在相互作用机制,协同作用促进MSCs成脂分化。综上所述,缺氧对MSCs成脂分化有促进作用；该促进作用不依赖于PPAR-γ途径；C/EBPs在缺氧促进MSCs成脂分化的过程中扮演了关键角色,Hif-1α和C/EBPs在缺氧下条件下存在相互作用,协同作用促进MSCs成脂分化。该研究阐明了在缺氧的微环境下的MSCs分化潜能的改变,为进一步研究分化后的MSCs对于肿瘤细胞的影响提供依据。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-12
英文縮略词表  12-13
第一章 前言  13-15
第二章 材料与方法  15-36
  2.1 材料  15-22
    2.1.1 仪器  15-16
    2.1.2 试剂及试剂盒  16-17
    2.1.3 耗材  17-18
    2.1.4 细胞、菌株和质粒  18
    2.1.5 引物序列  18-19
    2.1.6 Real-time PCR芯片  19
    2.1.7 主要试剂配制  19-22
  2.2 实验方法  22-36
    2.2.1 人骨髓MSCs分离与培养  22
    2.2.2 MSCs诱导分化与鉴定  22-24
    2.2.3 MSCs缺氧处理  24-25
    2.2.4 RNA提取以及Real-time PCR实验  25-28
    2.2.5 蛋白提取、定量和Western-blot  28-30
    2.2.6 慢病毒载体构建  30-34
    2.2.7 慢病毒包装和感染MSCs  34-35
    2.2.8 数据处理及统计学分析  35-36
第三章 结果  36-69
  3.1 MSCs的分离与鉴定  36-38
    3.1.1 骨髓间充质干细胞的原代培养  36-37
    3.1.2 MSCs分化能力的鉴定  37
    3.1.3 MSCs表面分子的流式鉴定  37-38
  3.2 缺氧与MSCs成骨、成脂分化  38-43
    3.2.1 缺氧抑制MSCs的成骨分化  38-40
    3.2.2 缺氧促进MSCs成脂分化  40-41
    3.2.3 MSCs在缺氧条件下末向内皮祖细胞分化  41-42
    3.2.4 缺氧促进MSCs的成脂分化标志物的表达  42-43
  3.3 缺氧下MSCs成脂相关调控因子分析  43-69
    3.3.1 Real-time PCR芯片构建缺氧成脂细胞生成调控网络  43-49
    3.3.2 PPAR-γ与缺氧下MSCs成脂分化  49-55
    3.3.3 C/EBPs与缺氧下MSCs成脂分化  55-58
    3.3.4 Hi-1α与缺氧下MSCs成脂分化  58-69
第四章 讨论  69-73
  4.1 缺氧促进MSCs的成脂分化潜能  69-70
  4.2 Hif-1α和C/EBPs的协同作用促进缺氧状态下MSCs的成脂分化潜能  70-73
结论  73-74
参考文献  74-78
综述  78-98
  参考文献  91-98
致谢  98-99
攻读硕士学位期间主要研究成果  99-100

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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