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免疫相关受体PirB在慢性炎症脑神经元突触丢失中的作用

作　者: 艾卫敏
导　师: 邓小华
学　校: 中南大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 脂多糖炎症 PirB 星形胶质细胞突触囊泡素基树突免疫组织化学高尔基染色 Western blot Morris水迷宫
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的1.探讨内毒素脂多糖诱导的慢性炎症脑神经元和星形胶质细胞 PirB的表达变化,突触囊泡素的表达及动物行为学的改变;2.探讨PirB在慢性炎症脑神经元突触丢失和学习记忆功能缺失中的免疫调节作用。方法正常成年SD大鼠,随机分为实验组和对照组,依赖立体定位技术,在大鼠右侧海马内分别注射LPS和PBS,动物存活30天。用免疫组织化学法检测大鼠脑皮质、海马PirB、突触囊泡素的表达及星形胶质细胞GFAP的表达变化,用图像分析系统检测阳性细胞数目和染色强度；并采用Western blot技术对其进行定量分析。高尔基染色观察大鼠脑神经元结构的改变。免疫荧光双重标记技术,观察PirB阳性细胞与神经元、星型胶质细胞的共存及PirB阳性细胞与突触的关系;Morris水迷宫测试用于评估实验组大鼠的学习和空间记忆能力。结果GFAP阳性星形胶质细胞分布在整个海马结构、梨状皮质和内嗅皮质、皮质以下的白质如胼胝体等部位。海马内注射PBS的对照组动物,海马、皮质内GFAP阳性的星形胶质细胞展示出静息的形态特征：胞体小,分支细长,染色较淡。海马内注射LPS的实验组动物海马、梨状皮质和内嗅皮质内GFAP阳性星形胶质细胞明显被激活,表现为细胞胞体明显增大,突起变肥大；定量分析表明,LPS处理30天后,海马CA3区和齿状回内GFAP阳性星形胶质细胞数目和光密度OD值明显增加,差异有显著性(P<0.01)。PBS注射组动物脑皮质V层内可见PirB阳性神经元样细胞,呈圆形、卵圆形和锥体形,免疫反应产物呈棕色,主要位于细胞膜上；海马内注射LPS30天后,可见较大的PirB阳性神经元样细胞和较小的PirB阳性神经胶质样细胞主要分布于皮质Ⅳ、V层、海马CA1-CA3区锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层,免疫反应产物位于胞质和突起内。定量分析表明,与对照组比较,LPS处理30d后,皮质、海马内PirB阳性神经元的数目和OD值明显增加,差异有显著性(P<0.005)。Western blot定量分析：LPS处理30天后,注射侧皮质、海马内PirB蛋白质的表达均明显增加,差异有显著性(P<0.001)。PirB分别与MAP-2、GFAP、CDllb的免疫荧光双重标记染色显示：皮质、海马内PirB和MAP-2阳性神经元的胞体存在共定位；PirB与GFAP阳性星形胶质细胞存在部分共定位,实验组海马内GFAP阳性星形胶质细胞明显被激活,活化的星形胶质细胞PirB表达上调,但未见PirB与CDllb阳性染色双标细胞。SYN阳性产物呈点状棕色颗粒,在PBS处理的大鼠海马主要分布于海马CA1区的始层、辐射层及分子层,CA3区阿蒙氏角神经纤维终末以及齿状回的非细胞层。与对照组相比,LPS处理的大鼠脑海马CA1区、齿状回内SYN免疫阳性产物的平均OD值明显减少,差异具有显著性(P <0.05)。SYN与PirB的免疫荧光双重标记染色显示：海马CA3区苔藓纤维终端和锥体神经元胞体内SYN与PirB两者存在共定位。Western blot定量分析：LPS处理30天后,皮质、海马内SYN蛋白质的表达均明显减少,差异有显著性(P<0.05)。高尔基染色结果显示：与对照组相比,实验组大鼠海马锥体神经元基树突长度、树突棘密度均明显减少,差异具有显著性(P<0.05)。Morris水迷宫行为学测试结果：在训练的第四天,与对照组相比,实验组大鼠寻找平台潜伏期延长,差异具有显著性(P<0.05)；在空间搜索实验中,对照组大鼠能依靠空间线索找到平台所在区域,其运动轨迹最多位于原平台象限,其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找,很少跨至对侧象限；实验组大鼠基本围绕池壁游泳,运动轨迹呈随机分布于各象限之中,较少游向原平台附近。实验组动物在原平台象限游泳停留时间占总时间的百分比明显减少,差异具有显著性(P<0.01)。结论LPS能够诱导大鼠皮质、海马星形胶质细胞活化和PirB蛋白表达上调,且部分活化的星形胶质细胞表达PirB,而突触囊泡素SYN蛋白表达下调,海马锥体神经元基树突长度及树突棘密度减少,学习记忆功能受损。海马CA3区苔藓纤维终末SYN阳性产物与PirB阳性产物共存。PirB可能参与脑内炎症突触可塑性改变和学习记忆功能缺失的免疫调节。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
英文缩略词  10-11
前言  11-13
第一章材料与方法  13-20
  1.1 实验动物  13
  1.2 主要试剂与设备  13-14
  1.3 实验方法  14-19
    1.3.1 模型制备  14-15
    1.3.2 组织制备  15
    1.3.3 ABC免疫组织化学染色  15-16
    1.3.4 PirB与MAP-2、GFAP和CD11b免疫荧光双重标记染色  16
    1.3.5 蛋白质免疫印迹分析(Western-Blot)  16-17
    1.3.6 行为学检测  17-18
    1.3.7 高尔基染色  18-19
  1.4 数据收集与处理  19-20
第二章结果  20-30
  2.1 海马内注射LPS后,皮质、海马内GFAP的表达  20-22
  2.2 海马内注射LPS后,皮质、海马内PirB的表达  22-23
  2.3 PirB与MAP-2、GFAP和CD11b免疫荧光双重标记染色  23-25
  2.4 海马内注射LPS后，海马、皮质内突触囊泡素的表达及与Pi rB阳性细胞的共存  25-26
  2.5 Morris水迷宫行为学结果  26-27
  2.6 高尔基染色  27-30
第三章讨论  30-33
第四章结论  33-34
参考文献  34-37
综述  37-47
  参考文献  42-47
致谢  47-48
攻读学位期间的主要研究成果  48

免疫相关受体PirB在慢性炎症脑神经元突触丢失中的作用

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