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三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与表达研究

作　者: 张樱
导　师: 金珊
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 三疣梭子蟹 LGBP SMART RACE RT-PCR 重组表达抗血清制备 Western blot
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)作为一种模式识别受体在甲壳动物的先天免疫中占有重要地位。本文以三疣梭子蟹为研究对象,采用分子克隆和重组表达技术,对三疣梭子蟹的LGBP进行了基因克隆、表达模式、体外重组表达以及与微生物结合能力等研究。用金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激三疣梭子蟹后,提取其血细胞总RNA。通过同源克隆获得了LGBP基因的保守片段,再利用SMART RACE技术克隆得到了基因全长。该基因cDNA序列全长为1378bp,包括1095bp的开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,在基因的5’端还含有138bp的非编码区(UTR),3’端含有144bp的UTR。预测的成熟肽分子量为39825.24 Da,等电点为4.49。同时用生物信息学方法对该基因的序列和二级结构进行了初步分析。RT-PCR结果显示LGBP基因在被检测的三疣梭子蟹组织,包括血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉中都有表达。用混合细菌刺激三疣梭子蟹后,发现血细胞中LGBP的表达量随刺激时间呈先增高后降低的变化趋势,且在12-48 h高于生理盐水对照组,推测该基因在在抵抗细菌感染的免疫过程中发挥着积极的作用。根据基因序列设计开放阅读框的表达引物,将基因片段克隆到pET-22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysE后进行重组表达。经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 kDa的表达产物。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30°C诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。重组蛋白经大量诱导并纯化后作为抗原免疫小鼠,免疫5次后获得到特异性好的鼠抗血清。选取3种革兰氏阴性菌(副溶血弧菌,Vibrio parahaemolyticus;溶藻弧菌,V.alginolyticus;大肠杆菌,Escherichia coli)、4种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌,Bacillus subtilis;巨大芽孢杆菌,Bacillus megaterium;蜡状芽孢杆菌,Bacillus cereus;金黄色葡萄球菌,S.aureus)和1种酵母菌(丹麦啤酒酵母,Sac-charomyces cerevisiae)进行微生物结合实验,结果显示pET-LGBP对丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌以及大肠杆菌有结合能力。本研究主要针对三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与表达,不仅为深入探讨三疣梭子蟹先天免疫功能和调节机制提供了基础数据,同时也为三疣梭子蟹免疫增强剂的研发及水产动物疾病的防治具有重要的指导价值。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 绪论  13-25
  1.1 甲壳动物免疫机制概述  13-17
    1.1.1 细胞免疫  13-14
    1.1.2 体液免疫  14-17
  1.2 模式识别  17-22
    1.2.1 病原相关分子模式  17
    1.2.2 模式识别受体  17-22
  1.3 脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白研究进展  22-23
  1.4 问题与展望  23-24
  1.5 本研究的目的与意义  24-25
2 三疣梭子蟹 LGBP 基因的克隆  25-43
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 实验动物  25
    2.1.2 主要试剂  25-26
    2.1.3 主要仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-35
    2.2.1 细菌刺激实验  27
    2.2.2 总RNA 的提取  27-28
    2.2.3 SMANT cDNA 的合成  28
    2.2.4 保守序列的克隆  28-31
    2.2.5 3’RACE  31-32
    2.2.6 5’RACE  32-35
    2.2.7 生物信息学分析  35
  2.3 结果与分析  35-41
    2.3.1 总RNA 提取结果  35
    2.3.2 保守序列的克隆  35
    2.3.3 3’RACE  35-36
    2.3.4 5’RACE  36
    2.3.5 LGBP 基因的生物信息学分析  36-41
  2.4 讨论  41-42
    2.4.1 SMART RACE 技术  41
    2.4.2 LGBP 特征分析  41-42
  2.5 本章小结  42-43
3 三疣梭子蟹LGBP 基因的表达模式分析  43-51
  3.1 实验材料  43-45
    3.1.1 实验动物  43
    3.1.2 主要试剂  43-44
    3.1.3 主要仪器  44-45
  3.2 实验方法  45-46
    3.2.1 总RNA 的提取  45-46
  3.3 实验结果  46-48
    3.3.1 三疣梭子蟹LGBP 基因的组织分布  46-47
    3.3.2 三疣梭子蟹LGBP 基因的表达模式分析  47-48
  3.4 讨论  48-49
    3.4.1 RT-PCR  48-49
    3.4.2 水产甲壳动物LGBP 基因的表达模式  49
  3.5 本章小结  49-51
4 三疣梭子蟹LGBP 基因的重组表达  51-68
  4.1 实验材料  51-53
    4.1.1 实验动物  51
    4.1.2 主要试剂  51-52
    4.1.3 主要仪器  52-53
  4.2 实验方法  53-60
    4.2.1 总RNA 的提取及SMART cDNA 的合成  53
    4.2.2 三疣梭子蟹LGBP 基因开放阅读框的克隆  53-54
    4.2.3 重组载体的构建  54-55
    4.2.4 重组表达  55-56
    4.2.5 不同诱导条件下重组蛋白的表达  56-57
    4.2.6 非融合蛋白的纯化  57
    4.2.7 抗血清的制备  57-58
    4.2.8 Western blot  58-59
    4.2.9 微生物结合实验  59-60
  4.3 结果与分析  60-66
    4.3.1 LGBP 基因ORF 分析  60-61
    4.3.2 重组载体的鉴定  61-62
    4.3.3 重组表达  62-64
    4.3.4 非融合蛋白的纯化  64
    4.3.5 血清效价及Western blot 结果  64-65
    4.3.6 微生物结合实验  65-66
  4.4 讨论  66-67
    4.4.1 表达载体的选择  66
    4.4.2 重组表达条件的优化  66
    4.4.3 抗血清的制备及鉴定  66-67
  4.5 本章小结  67-68
5 总结  68-69
参考文献  69-77
在学研究成果  77-78
致谢  78

三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与表达研究

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