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NDRG2在肝损伤修复过程中的表达和功能研究

作　者: 杨建栋
导　师: 窦科峰
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: NDRG2 肝再生细胞周期凋亡肝纤维化 TGF-β1 Smad 基质金属蛋白酶金属蛋白酶组织抑制因子
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

人NDRG2（N-myc downstream regulated gene2）基因为我校生化教研室首先发现并报道，该基因与细胞增殖和分化相关，但其具体的生物学功能尚未完全阐明。前期研究表明，NDRG2与肝脏的形成有密切关系。利用免疫组化、免疫荧光检测NDRG2在小鼠胚胎发育不同时期以及成年小鼠肝脏组织的表达情况，结果发现NDRG2普遍定位于肝细胞胞浆中，随着胚胎的发育，NDRG2在肝脏中逐渐表达，呈动态性变化，在胚胎早期表达量低，后期显著升高。在成年小鼠的肝脏组织中可见表达。人类胚胎组织中，NDRG2mRNA和蛋白在肝脏中也呈现出动态变化，28周龄胚胎中的表达量要高于16周龄。NDRG2作为抑癌基因（已收录《Encyclopedia of Cancer》），参与了肝癌的发生，转移等过程。RT-PCR检测29例肝癌及癌旁正常组织中NDRG2的mRNA，结果显示肝癌组织中NDRG2的表达与癌旁及正常组织相比显著降低，这种降低与其启动子高甲基化有关。细胞水平的研究表明，转染了表达NDRG2腺病毒载体的Hep G2肝癌细胞发生明显的形态改变，细胞周期阻滞，凋亡增加。韩国学者的实验证实NDRG2的表达水平与肝癌的分化呈正相关，与肿瘤的恶性程度，如TNM分期，血管侵袭，淋巴结或远处转移，肝癌复发，患者生存率等呈负相关。高表达NDRG2可以使SK-Hep-1（恶性程度较高）肝癌细胞系增殖，侵袭，迁移能力降低；而siRNA介导的NDRG2下调可以增强PLC/PRF/5（恶性程度较低）肝癌细胞系的恶性程度。进一步研究发现，NDRG2可以减少MMP2和laminin332的表达，抑制Rho GTPase的活性，从而阻断了TGF-β1介导的肝癌浸润转移。另外，有实验表明NDRG2在肝纤维化的过程中表达下降。而我们基因芯片的结果证实，在HeLa细胞中上调NDRG2的表达，可以抑制PDGFRA，后者是最有力的促肝星形细胞有丝分裂因子之一。以上研究证明，NDRG2参与调控了肝脏的器官发育形成，肝癌的发生发展。而肝脏再生的过程，其实就是肝细胞增殖分化，肝脏器官“二次”发育的过程。肝纤维化过程中，同样伴随着肝细胞增殖，分化，凋亡以及肝星形细胞的活化。因此，我们推测，作为调控细胞增殖分化，器官发育成熟的重要分子，NDRG2很有可能参与了肝脏再生和肝纤维化这两个重要的肝损伤修复的调控过程。【目的】1、明确NDRG2在大鼠再生肝脏组织和大鼠正常肝脏细胞中分布和定位；2、研究NDRG2对肝细胞周期和凋亡的影响及调控机制；3、明确NDRG2在肝星形细胞中分布和定位及其对肝星形细胞活化的影响和调控机制；4、研究NDRG2对大鼠肝纤维化的治疗作用及机制。【方法】1、建立大鼠70%肝脏切除模型，通过Real-time PCR, Western Blot和间接免疫荧光的方法在动物模型上观察部分肝脏切除后NDRG2的定位，含量的动态变化以及NDRG2的表达与C-Myc的关系。2、在细胞水平通过改变NDRG2的表达，流式细胞仪检测NDRG2对正常肝细胞增殖及凋亡的影响。3、Real-time PCR和Western Blot检测调控肝细胞周期和凋亡的关键调节分子，阐明NDRG2参与调控肝再生的分子机制。4、通过Real-time PCR, Western Blot和细胞免疫荧光的方法检测肝星形细胞中NDRG2的定位及表达；利用腺病毒载体上调肝星形细胞中NDRG2的表达，检测其对肝星形细胞活化的影响。5、Real-time PCR和Western Blot检测TGF-β1/Smad通路和MMP2/TIMP2系统，阐明NDRG2调控肝星形细胞活化的机制。6、建立大鼠二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型，HE染色，天狼星红染色，TUNEL染色，免疫组化，Real-timePCR, Western Blot等方法检测表达NDRG2的腺病毒载体对大鼠肝纤维化的治疗作用及机制。【结果】1、NDRG2基因和蛋白在大鼠再生肝脏早期表达降低，晚期升高NDRG2基因和蛋白在部分肝切除后早期即开始降低，48h达到最低点，然后逐渐上升，于72h达到峰值。NDRG2蛋白表达的最低点与肝细胞增殖达到峰值都发生在部分肝切除后48h。C-Myc与NDRG2在部分肝切除后肝再生过程中的表达变化呈负相关。2、NDRG2抑制大鼠肝细胞增殖，促进肝细胞凋亡腺病毒载体上调大鼠正常肝脏细胞系BRL细胞中NDRG2的表达水平，48小时后，周期分析结果显示实验组中G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，说明肝细胞发生了G1/S期阻滞。凋亡检测发现实验组中凋亡细胞数量显著增加。这些现象在另外两种肝脏细胞系BRL3A和L-02细胞中同样可以观察到。3、NDRG2上调p53, p21, Bax/Bcl-2,抑制Cyclin E-CDK2复合物在大鼠正常肝脏细胞中上调NDRG2，可以提高p53，p21的转录，抑制Cyclin E的表达，提高Bax的表达，从而起到了抑制大鼠肝细胞增殖，促进肝细胞凋亡的调节作用。4、NDRG2抑制肝星形细胞活化NDRG2在肝星形细胞活化的过程中表达逐渐下降，利用腺病毒载体上调肝星形细胞中NDRG2的表达能够抑制肝星形细胞的活化。5、NDRG2抑制TGF-β1/Smad通路，提高MMP2/TIMP2的比值肝星形细胞活化后，Smad2/3/7的基因和蛋白表达增加，Smad2/3的磷酸化水平提高。而NDRG2能够使Smad3的表达和磷酸化水平降低。同时，肝星形细胞活化后，MMP2和TIMP2的表达增加，而NDRG2能够促进MMP2的表达，抑制TIMP2的表达，从而提高了MMP2/TIMP2的比值。6、NDRG2能够抑制DMN诱导的大鼠肝纤维化，改善肝功能DMN诱导大鼠肝纤维化后，肝细胞中NDRG2的表达下降，α-SMA表达增加，肝脏间质中胶原沉积，肝功能受损。通过尾静脉注射表达NDRG2的腺病毒载体后，提高了肝脏中NDRG2的表达，抑制了肝星形细胞活化，加速了胶原的降解，并且改善了肝功能。这一作用是通过抑制TGF-β1/Smad通路，提高MMP2/TIMP2的比值实现的。另外，NDRG2能够促进肝细胞增殖。【结论】本课题揭示了NDRG2是调控肝损伤修复的重要分子，初步证实NDRG2参与调控肝再生和肝纤维化的过程，为临床上促进肝再生和治疗肝纤维化提供了新的靶向分子。

NDRG2在肝损伤修复过程中的表达和功能研究

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