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马铃薯多酚类化合物对结肠癌和肝癌细胞增殖的影响及花色苷生物合成关键酶基因的研究

作　者: 王全逸
导　师: 杨清
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 马铃薯多酚花色苷抗癌活性基因克隆遗传转化
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物多酚(plant polyphenols)是多羟基酚类化合物的总称。植物多酚类化合物在体外有较强的抗氧化作用,并且具有天然、高效、低毒等优点。因此,近年来有关多酚类化合物的生化与分子生物学研究,引起了全世界科学家的广泛关注和浓厚兴趣,并将成为今后开发天然抗氧化剂的主要方向。马铃薯含有大量的抗氧化活性物质,包括多酚,维他命c和类胡萝卜素,其中彩色马铃薯块茎中的抗氧化剂含量较高,主要成分是花色苷。探讨马铃薯多酚类化合物体外抗癌效应及作用机制、阐明不同马铃薯品种中花色苷生物合成的分子基础,可以为进一步利用马铃薯色素开发天然抗氧化剂以及彩色马铃薯研制提供理论和实践依据,具有十分重要的研究价值。本研究以不同颜色的马铃薯(Solarium tuberosum)品种为材料,通过测定抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量、花色素含量和体外抑制癌细胞增殖效应,分析马铃薯多酚类化合物的抗癌活性与作用机制；通过同源克隆方法,克隆了马铃薯花色苷合成关键酶基因CHI,并对不同马铃薯品种花色苷生物合成关键基因的结构和表达差异进行了分析；进一步选取花色苷合成关键酶基因3GT遗传转化白皮马铃薯品种。研究结果如下：1.马铃薯多酚类化合物的抗氧化活性。采用了两种不同有机溶剂提取方法,得到四个马铃薯栽培品种和一个马铃薯野生种总酚提取物,分别测定了其抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量和花色素含量,结果表明,(1)马铃薯野生种S. pinnatisectum抗氧化活性、总酚含量和绿原酸含量最高,其次为紫薯’Purple Majesty’、’Bora Valley’和红薯’Mountain Rose’,白薯’Northstar’最低,同时彩色薯的花色素含量高于白薯；(2)抗氧化活性与总酚、绿原酸和花色素含量之间存在极显著的正相关性；(3)两种不同有机溶剂提取方法分别得到溶液状和粉末状马铃薯提取物,对其进行总酚含量和抗氧化活性测定后得到的结论是一致的。2.马铃薯多酚提取物对人体结肠癌Caco-2细胞和肝癌HepG2细胞体外增殖的抑制效应。分别采用形态学观察和XTT比色法检测了四个马铃薯栽培品种和一个野生种的多酚提取物以及三种马铃薯块茎含有的酚类标准物对癌细胞增殖的影响,结果表明,(1)马铃薯多酚类化合物明显抑制癌细胞体外增殖,且浓度越高,增殖率越低,其中野生种S. pinnatisectum抑制癌细胞的效果最明显,彩色马铃薯栽培品种’Mountain Rose’、’Bora Valley’和’Purple Majesty’比白色品种’Northstar’具有更好的抑制效果；马铃薯多酚含量、抗氧化活性和抗癌活性三者之间存在显著的正相关性；(2)天然多酚类化合物绿原酸和花色素都显著抑制癌细胞的生长,并且浓度越高,增殖率越低,其中绿原酸抑制癌细胞增殖的效果最好,其次为天竺葵素和锦葵素。3.马铃薯花色苷合成关键酶基因CHI的克隆与表达分析。(1)采用RT-PCR的方法在马铃薯野生种S. pinnatisectum中克隆得到查尔酮异构酶基因CHI cDNA和gDNA序列,该基因无内含子,包含一个全长为657bp的开放阅读框,编码一个由218氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白的分子量为24.46kDa,理论等电点为7.68,采用DNAMAN对CHI和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明马铃薯CHI氨基酸序列与茄科植物番茄的同源蛋白序列一致性最高,亲缘关系也最近。(2)采用半定量RT-PCR方法对CHI mRNA水平空间表达分析显示,该基因在马铃薯的匍匐茎、膨大的匍匐茎、成熟块茎、顶芽、花和根中都有表达,其中在膨大的匍匐茎和根中表达水平较高,在匍匐茎和块茎中表达水平基本相当,也都比较高,在芽和花中有低水平的表达,茎和叶中没有检测到。4.马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因的结构和表达分析。(1)红皮马铃薯栽培品种’Chieftain’和白皮品种’Superior’的叶片基因组DNA中都含有花色苷生物合成的关键酶基因CHS、CHI、F3H、DFR和3GT,将扩增获得的gDNA序列和GenBank中相应的cDNA序列进行比对,结果显示,CHI和3GT基因不含有内含子,CHS含有一个内含子和两个外显子,F3H基因含有两个内含子和三个外显子,DFR基因含有五个内含子和六个外显子；(2) CHS. CHI、F3H、DFR和3GT在红皮马铃薯栽培品种’Desiree’、’Chieftain’和白皮品种’Superior’中的表达差异分析显示,除了CHI,其他四个基因在地上部分叶片中都表达；在地下部分的匍匐茎和块茎中,这五个基因都在红薯中表达；而在白薯中,只有最上游的CHS基因在匍匐茎中有所表达,其他基因都没有检测到。由此可见,白薯’Superior’中没有花色苷的合成可能与花色苷生物合成相关基因CHI及其下游基因的不表达有关。5.通过农杆菌介导的遗传转化将3GT基因导入到白皮马铃薯栽培品种’Superior’中,共得到了18个Kan抗性株系,通过PCR检测,有3株表现为阳性。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩略词表  13-14
引言  14-16
第一章文献综述  16-48
  1.1 植物多酚概述  16-26
    1.1.1 植物多酚类化合物的分布  16-17
    1.1.2 植物多酚类化合物的化学结构及分类  17-19
    1.1.3 植物多酚类化合物的提取方法  19-21
    1.1.4 植物多酚类化合物的测定方法  21-22
    1.1.5 植物多酚类化合物的生理功能  22-24
    1.1.6 植物多酚类化合物的应用现状  24-26
  1.2 植物多酚的药理作用  26-34
    1.2.1 抗氧化作用  26-30
    1.2.2 预防心脑血管疾病作用  30-31
    1.2.3 抗突变和抗肿瘤、防癌作用  31-32
    1.2.4 抑菌消炎和抗病毒  32-33
    1.2.5 调节机体免疫功能作用  33
    1.2.6 抗辐射作用  33
    1.2.7 其它药理作用  33-34
  1.3 植物多酚在医药中的应用  34-36
    1.3.1 天然抗氧化剂  34
    1.3.2 治疗心脑血管病药物  34
    1.3.3 解毒护肝药物  34-35
    1.3.4 抑菌消炎、抗病毒药物  35
    1.3.5 保健品类  35-36
  1.4 植物花色苷基因工程研究进展  36-48
    1.4.1 花色苷的生物合成  37-42
    1.4.2 影响花色苷合成与积累的主要因素  42-44
    1.4.3 花色苷基因工程改良的基本策略  44-45
    1.4.4 植物基因工程改良的安全性  45-48
第二章马铃薯块茎中总酚的含量和抗氧化活性分析  48-58
  2.1 材料与方法  48-52
    2.1.1 植物材料  48-49
    2.1.2 主要试剂和溶液的配制  49
    2.1.3 马铃薯总酚的提取  49-50
    2.1.4 DPPH法测定马铃薯提取物的抗氧化活性  50
    2.1.5 Folin-Ciocalteu比色法测定马铃薯提取物的总酚含量  50-51
    2.1.6 钼酸钠比色法测定马铃薯提取物的绿原酸含量  51
    2.1.7 马铃薯提取物花色素含量的测定  51
    2.1.8 统计分析  51-52
  2.2 实验结果  52-55
    2.2.1 标准曲线的绘制  52-53
    2.2.2 不同品种马铃薯提取物的抗氧化活性及其成分测定分析  53-54
    2.2.3 马铃薯提取物的抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量和花色素含量的相关性分析  54-55
  2.3 讨论  55-58
    2.3.1 马铃薯提取物的抗氧化活性和成分测定  55-56
    2.3.2 马铃薯提取物抗氧化活性与总酚、绿原酸、花色素含量的相关性分析  56
    2.3.3 马铃薯多酚类化合物不同提取方法的比较  56-58
第三章马铃薯多酚提取物对人体结肠癌和肝癌细胞增殖的影响  58-74
  3.1 材料与方法  59-62
    3.1.1 植物材料  59
    3.1.2 主要仪器  59
    3.1.3 主要试剂和溶液的配制  59-60
    3.1.4 癌细胞培养  60
    3.1.5 XTT比色法检测马铃薯多酚提取物和酚类标准物对癌细胞的毒性  60-61
    3.1.6 统计分析  61-62
  3.2 实验结果  62-71
    3.2.1 癌细胞生长的形态学观察  62-63
    3.2.2 马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响  63-67
    3.2.3 马铃薯提取物抑制癌细胞增殖的半数效量与多酚含量和抗氧化活性的相关性分析  67-68
    3.2.4 天然多酚类标准物对癌细胞增殖的影响  68-71
  3.3 讨论  71-74
    3.3.1 马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响  71-72
    3.3.2 天然多酚类标准物对癌细胞增殖的影响  72-74
第四章马铃薯CHI基因的克隆与表达分析  74-86
  4.1 材料与方法  74-78
    4.1.1 植物材料  74-75
    4.1.2 主要试剂和溶液的配制  75
    4.1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成  75
    4.1.4 基因组DNA的提取  75-76
    4.1.5 马铃薯野生种CHI cDNA和gDNA的扩增与组织表达分析  76-77
    4.1.6 马铃薯野生种CHI基因的组织表达半定量RT-PCR分析  77
    4.1.7 生物信息学分析  77-78
  4.2 实验结果  78-83
    4.2.1 CHI基因的克隆与序列分析  78-83
    4.2.2 利用半定量RT-PCR方法分析CHI基因的组织表达特性  83
  4.3 讨论  83-86
    4.3.1 马铃薯CHI基因的克隆与生物信息学分析  83-84
    4.3.2 马铃薯CHI基因的空间表达模式  84-86
第五章马铃薯栽培种中花色苷生物合成关键酶基因的结构和表达分析  86-94
  5.1 材料与方法  86-88
    5.1.1 植物材料  86
    5.1.2 主要试剂和溶液的配制  86-87
    5.1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成  87
    5.1.4 基因组DNA的提取  87
    5.1.5 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因gDNA全长的扩增  87-88
    5.1.6 红色和白色马铃薯栽培种的花色苷合成关键酶基因的表达分析  88
  5.2 分析结果  88-92
    5.2.1 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构分析  88-91
    5.2.2 白色和红色马铃薯品种中花色苷合成关键酶基因的表达差异分析  91-92
  5.3 讨论  92-94
    5.3.1 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构分析  92
    5.3.2 马铃薯栽培种中花色苷合成关键酶基因的表达差异分析  92-94
第六章马铃薯3GT基因的遗传转化  94-102
  6.1 实验材料  94-95
    6.1.1 供试材料  94-95
    6.1.2 菌株与质粒  95
    6.1.3 主要培养基的配制  95
  6.2 实验方法  95-97
    6.2.1 pBin19/G-3GT的农杆菌转化  95-96
    6.2.2 菌液制备  96
    6.2.3 遗传转化  96
    6.2.4 Kan选择压的筛选  96
    6.2.5 再生植株的抗性筛选  96-97
    6.2.6 转基因马铃薯的PCR检测  97
  6.3 实验结果  97-99
    6.3.1 农杆菌转化及质粒检测  97-98
    6.3.2 Kan选择压的确定  98
    6.3.3 转基因马铃薯植株再生  98-99
    6.3.4 转基因植株的PCR检测  99
  6.4 讨论  99-102
全文结论  102-104
本研究的创新点  104-106
参考文献  106-124
附录  124-130
攻读博士学位期间发表的研究论文  130-132
致谢  132

马铃薯多酚类化合物对结肠癌和肝癌细胞增殖的影响及花色苷生物合成关键酶基因的研究

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