学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水蛭生物活性测定质量控制方法的研究-APTT法

作　者: 宋程程
导　师: 王志斌
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药药理学
关键词: 活化部分凝血活酶时间活血化瘀生物活性测定水蛭质量控制
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 10次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

水蛭是常用活血化瘀中药,其临床功效、作用特点及作用机制较为明确,临床应用广泛,根据2010版《中国药典》规定了其以抗凝血酶作用靶点的质量控制方法以及传统的理化鉴定方法,这些均不能有效控制水蛭临床应用的有效性及安全性。本课题在综合考察水蛭活血化瘀活性的基础上,其包括水蛭对血液流变学、抗血栓形成以及抗凝血活性实验,对水蛭进行综合评价,并通过水蛭体内外药效实验一致性分析后,建立水蛭生物活性质量控制方法,并进行方法学考察,以推动水蛭的科学、全面评价,有效控制水蛭临床应用的有效性及安全性。本论文是本课题的一部分内容,在中医药学理论和生物检定统计法的双重指导下,以活化部分凝血活酶时间(APTT)为指标,建立了水蛭的生物活性测定方法并进行了方法学考察。主要研究内容和结果如下第一部分课题总论由于本课题是由两名研究生同学共同完成,所以首先对本课题进行总体概述,对实验所用药品进行概述,并阐述本论文相关实验内容。第二部分水蛭体内药效学研究(部分)一大鼠血瘀模型筛选实验用不同造模方法制备了寒凝血瘀、肾上腺素、右旋糖酐、高脂寒凝、高脂血症及血虚血瘀六种大鼠血瘀模型,比较不同大鼠血瘀模型全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集变形性、红细胞压积(HCT)、血小板聚集性、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)和纤维蛋白原(Fibg)含量的差异性。实验结果显示,肾上腺素、高脂血症、高脂寒凝及血虚血瘀大鼠血瘀模型的血液流变学指数及凝血参数有变化,其中肾上腺素血瘀模型变化较为显著,适用性较好；右旋糖酐血瘀模型的血液流变学相关指标有显著变化,特别是红细胞相关指标较为显著；寒凝血瘀组能显著影响凝血参数。综合考虑后选择肾上腺素模型进行水蛭治疗血瘀证的药效学研究。二水蛭对急性血瘀模型大鼠血液流变学影响实验大鼠连续给药两周后,通过皮下注射盐酸肾上腺复合冰浴的方法复制大鼠急性血瘀模型,通过测定全血粘度,血浆粘度,红细胞压积(Hct),红细胞变形指数和红细胞聚集指数,观察水蛭和脉血康对血液流变学的影响。结果显示水蛭能够显著降低血瘀模型大鼠全血粘度、血浆粘度；脉血康能够降低全血粘度。水蛭和脉血康均有显著改善血液流变学和凝血功能的作用。三水蛭抗血栓形成实验以大鼠动静脉旁路血栓法、大鼠电刺激血栓法及角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓法测定水蛭及脉血康胶囊抑制血栓形成的作用。结果显示,大鼠动静脉旁路血栓实验,结果显示水蛭各剂量及脉血康中剂量能显著降低血栓湿重与干重,水蛭脉血康胶囊均能显著延长TT；水蛭大、中剂量和脉血康胶囊大剂量均能延长成栓25%、50%及95%时间,而脉血康胶囊中剂量与小剂量仅能延长成栓95%时间,水蛭及脉血康均能降低FIB含量；水蛭及脉血康各剂量能显著缩短24h后及48h后的血栓相对长度,能显著延长凝血时间。可知水蛭、脉血康胶囊对抑制血栓的初步形成有较好的作用。第三部分水蛭体外药效学研究(部分)通过水蛭体内外药效学的一致性分析,最后选定了APTT法与TT-Fibg法进行水蛭生物活性测定方法的建立,本论文该部分仅对水蛭体外APTT法进行研究,并对APTT法与纤维蛋白原平板法、凝血酶滴定法进行比较。一纤维蛋白原平板法以纤维蛋白原作为底物,在纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应,精确测量沉淀圈直径,绘制标准凝血酶活力标准曲线。在标准曲线上查出凝血酶与水蛭反应后的剩余凝血酶活力,计算出水蛭活性。本课题要检测的是中药水蛭,不免会有各种未知成分干扰实验结果,而且结果较为混乱,并未得出较为理想的数据,而且存在一系列的问题,对于该方法用于水蛭的检测,还需进一步讨论。二不同批次水蛭凝血酶滴定法与APTT法测定结果比较由三个基源水蛭APTT法测定结果比较可知,其中日本医蛭呈“指数函数”,蚂蟥与柳叶蚂蟥为“S”形曲线,以APTT法的测定结果,可知三者的量效比例为蚂蟥：柳叶蚂蟥：水蛭=1：2：2。蚂蟥与柳叶蚂蟥同样可以与水蛭有想近或相同的药效,临床上可以应用蚂蟥与柳叶蚂蟥。凝血酶滴定法实验中,测定结果为抗凝效果强弱为医蛭>湖北蚂蟥>安徽蚂蟥=福建柳叶蚂蟥,且医蛭的抗凝效果远远大于蚂蟥和柳叶蚂蟥。通过与凝血酶滴定法测定结果对比可知,两者方法测定的药物成分不同,凝血酶只是针对于水蛭抗凝血酶成分,较为单一,而APTT法是在水蛭的整体水平测定抗凝作用,该方法具有一定优势。三不同批次水蛭高温处理后凝血酶滴定法与APTT法测定结果比较通过查阅文献,水蛭素的稳定性在70-80℃,通过高温处理后理论上将水蛭素灭活,通过凝血酶滴定法与APTT法测定水蛭的抗凝作用,并对两者进行比较。将调至烘箱为100℃和150℃,烘干时间分别均为1h、2h、4h、和8h,取出后进行凝血酶滴定测定和APTT法测定,同时设置空白组对照。凝血酶滴定法测定结果为,随着温度和时间的变化,蚂蟥与柳叶蚂蟥效价基本没变化,而医蛭蛭的抗凝作用在100℃时有所降低,而150℃时基本没有抗凝作用。本文认为蚂蟥与柳叶蚂蟥的抗凝血酶成分基本一致,而与医蛭的抗凝血酶成分并不同。APTT法测定结果为,随着温度和时间的变化,蚂蟥、柳叶蚂蟥及医蛭三个基源的药物变化基本一致,100℃时药物APTT值都有高低起伏变化,而到150℃时,APTT值基本降为空白值,基本都没有抗凝作用,本文认为三者的抗APTT成分一致,三者同样有效。第四部分APTT法用于水蛭生物活性测定质量控制方法的建立及方法学考察APTT法量效关系考察时,由于水蛭不同基源其曲线不同,日本医蛭呈“指数函数”,蚂蟥与柳叶蚂蟥为“s”形曲线,将采用日本医蛭建立一个实验体系,蚂蟥与柳叶蚂蟥建立另一个实验体系。选择合适供试品,对APTT法进行线性范围考察,标准品效价定义,供试品效价测定,进而建立水蛭生物活性测定APTT法方法体系,并进行了实验室内的方法学考察,包括准确度考察、重复性考察、中间精密度考察、稳定性考察以及方法适用性的考察五个方面,从而初步建立了水蛭体外APTT法生物活性测定方法。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
英文縮略词表  12-13
综述  13-18
前言  18-19
第一部分总论  19-22
第二部分水蛭体内药效学研究(部分)  22-47
  第一节大鼠血瘀模型筛选实验  22-30
    材料和方法  22-24
    结果  24-28
    讨论  28-30
  第二节水蛭及脉血康胶囊对大鼠急性血瘀模型血液流变学影响的实验  30-34
    材料和方法  30-31
    结果  31-33
    讨论  33-34
  第三节水蛭及脉血康胶囊抗血栓形成实验  34-45
    (一) 水蛭及脉血康胶囊对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响  34-37
      材料和方法  34-35
      结果  35-37
      讨论  37
    (二) 水蛭及脉血康胶囊对大鼠电刺激血栓形成的影响  37-41
      材料和方法  37-38
      结果  38-40
      讨论  40-41
    (三) 水蛭及脉血康胶囊对角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓形成的影响  41-45
      材料和方法  41-42
      结果  42-44
      讨论  44-45
  第四节水蛭抗凝血实验(小结)  45-46
  第五节水蛭体内药效学小结  46-47
第三部分水蛭体外药效学研究(部分)  47-63
  第一节水蛭抗凝血体外实验(小结)  47-49
  第二节纤维蛋白原平板法  49-53
    材料和方法  49-50
    结果  50-51
    讨论  51-53
  第三节不同批次水蛭体外APTT法实验  53-57
    材料和方法  53
    结果  53-56
    讨论  56-57
  第四节不同批次水蛭高温预处理后凝血酶滴定发与APTT法测定结果比较  57-62
    材料和方法  57-58
    结果  58-61
    讨论  61-62
  第五节水蛭体外药效学小结  62-63
第四部分 APTT法用于水蛭生物活性质量控制方法的建立及其方法学考察  63-98
  第一节 APTT法用于水蛭生物活性质量控制方法的建立  63-79
    1 APTT法反应体系的建立  63-64
    2 量效关系的考察  64-67
    3 标准品及效价的定义  67-70
    4 生物统计方法的选择  70
    5 效价的测定  70-77
    6 小结  77-79
  第二节 APTT法用于水蛭生物活性质量控制方法的方法学考察  79-98
    1 准确度考察(加标回收实验)  79-80
    2 重复性考察  80-82
    3 中间精密度考察  82-83
    4 稳定性考察  83-93
    5 方法适用性考察  93-95
    6 水蛭体外APTT法生物活性测定方法操作规程(SOP)的建立  95-96
    7 小结  96-98
结语和展望  98-101
  总结  98-99
  创新点  99-100
  问题与展望  100-101
参考文献  101-105
致谢  105-107
个人简历  107

水蛭生物活性测定质量控制方法的研究-APTT法

内容摘要

全文目录

相似论文