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靶向多功能防栓融合蛋白的表达研究

作　者: 高建阁
导　师: 胡宗利
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: LL-37 水蛭素溶栓抗炎抗凝
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 21次
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内容摘要

LL-37是Cathelicidin蛋白N端的37个氨基酸,不仅具有广泛的抗菌、抗病毒活性,还具有调节凝血、免疫作用。HV具有良好的抗凝血、抗血栓作用,对血栓疾病有较好的预防和治疗效果。HV-12-P是具有最大抗凝活性的最小肽段,它与纤维蛋白原竞争性地结合凝血酶,抑制其活性,进而阻止纤维蛋白形成,防止血栓形成和发展。通过对HV-12-P结构修饰可以延长半衰期、降低副作用及增加新功能,如RGD融合HV-12-P。长期以来抗血栓研究局限在溶血、抗凝血机制与血栓形成的研究,对于炎症或者病菌性感染与血栓病理过程的关系探讨较少。炎症是血栓性疾病的重要组成部分,炎症反应有利于凝血,而血栓形成的过程也能扩大炎症反应。本研究结合LL-37的多功能特性和HV的高抗凝性,将FXa识别序列融合在LL-37和HV-12-P之间,从而期望获得既具有LL-37抗炎免疫、清除内毒素、调节凝血的多功能特性,又具有HV抑制凝血和抗血栓形成的作用。同时将AAP三肽序列融合在水蛭素12肽C端,接着添加一个亮氨酸连接RGD肽,以增强抗血小板聚集作用。除外,在目的蛋白N端增加一个6×His Tag便于蛋白的分离纯化,以期为大量生产成为具有抗炎、抗凝活性和保护血管内皮细胞的多功能融合蛋白提供有效的基因工程手段。抑菌试验表明LL-37并没有因为成为融合蛋白组分而丧失其活性;血小板聚集测定结果说明LHAD具有很好的抗血小板聚集活性;通过测定抗凝血酶活性和比活性、PT、APPT得出,起初LHAD抗凝血酶活性非常低,随着FXa酶切浓度的加大,HV-12-P逐渐释放,抗凝活性逐渐增强;当用FXa完全酶切后抗凝活性最强,此时PT、APPT值与天然HV相比,稍微大于后者,可能LL-37参与了凝血过程并起到促进作用,也证明了LHAD的靶向定位性质。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-9
缩略词表  9-10
1 绪论  10-22
  1.1 血栓形成机理  10-12
    1.1.1 血栓形成因素  10-12
    1.1.2 血栓形成过程  12
  1.2 纤溶系统  12-13
  1.3 LL-37  13-14
  1.4 FXa  14-15
  1.5 水蛭素  15
  1.6 AAP  15-16
  1.7 RGD  16
  1.8 炎症反应与血栓形成  16-19
  1.9 研究目的、意义与内容  19-22
    1.9.1 研究目的及意义  19
    1.9.2 研究内容  19-22
2 靶向多功能融合蛋白LHAD 的基因合成  22-34
  2.1 材料与仪器  23-24
    2.1.1 材料  23-24
    2.1.2 主要仪器设备  24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 设计并合成引物  24-25
    2.2.2 目的基因的PCR 扩增  25-27
    2.2.3 融合蛋白基因LHAD 的T-载体连接及转化  27-30
  2.3 实验结果与分析  30-31
    2.3.1 融合蛋白LHAD 基因的PCR 扩增  30-31
    2.3.2 融合蛋白基因LHAD 的重组子筛选  31
    2.3.3 融合蛋白基因LHAD 的测序验证  31
  2.4 小结  31-34
3 靶向多功能融合蛋白LHAD 在大肠杆菌中的表达  34-52
  3.1 材料与仪器  35-37
    3.1.1 材料  35-37
    3.1.2 主要仪器设备  37
  3.2 实验方法  37-45
    3.2.1 pET-32-LHAD 表达载体的构建  37-40
    3.2.2 融合蛋白在大肠杆菌中的初步诱导表达  40-41
    3.2.3 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件优化  41-42
    3.2.4 融合蛋白在大肠杆菌中的定位及可溶性分析  42-43
    3.2.5 融合蛋白的亲和层析  43-44
    3.2.6 BCA 法测定蛋白浓度  44
    3.2.7 融合蛋白的Western-Blot 验证  44-45
  3.3 实验结果与分析  45-50
    3.3.1 pET-32-LHAD 表达载体的构建  45
    3.3.2 融合蛋白在大肠杆菌中的初步诱导表达  45-46
    3.3.3 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件优化  46-47
    3.3.4 融合蛋白在大肠杆菌中的定位及可溶性分析  47
    3.3.5 融合蛋白的亲和层析  47-48
    3.3.6 BCA 法测定蛋白浓度  48-49
    3.3.7 融合蛋白的Western-Blot 验证  49-50
  3.4 小结  50-52
4 靶向多功能融合蛋白LHAD 在毕赤酵母中的表达  52-70
  4.1 材料与仪器  53-54
    4.1.1 材料  53-54
    4.1.2 主要仪器设备  54
  4.2 实验方法  54-62
    4.2.1 pPIC9K-LHAD 表达载体的构建  54-56
    4.2.2 质粒的线性化  56-57
    4.2.3 GS115 酵母感受态细胞的制备  57
    4.2.4 电转化  57
    4.2.5 重组子的抗性筛选和表型鉴定  57-58
    4.2.6 重组子的PCR 检测  58-59
    4.2.7 融合蛋白在毕赤酵母中的初步诱导表达  59-60
    4.2.8 融合蛋白在毕赤酵母中的诱导表达条件优化  60-61
    4.2.9 融合蛋白的亲和层析  61
    4.2.10 BCA 法测定蛋白浓度  61
    4.2.11 融合蛋白的Western-Blot 验证  61-62
  4.3 实验结果与分析  62-68
    4.3.1 pPIC9K-LHAD 表达载体的构建  62
    4.3.2 质粒的线性化  62
    4.3.3 重组子的抗性筛选和表型鉴定  62-63
    4.3.4 重组子的PCR 检测  63
    4.3.5 融合蛋白在毕赤酵母中的初步诱导表达  63-64
    4.3.6 融合蛋白在毕赤酵母中的诱导表达条件优化  64-66
    4.3.7 融合蛋白的亲和层析  66-67
    4.3.8 BCA 法测定蛋白浓度  67
    4.3.9 融合蛋白的Western-Blot 验证  67-68
  4.4 小结  68-70
5 靶向多功能融合蛋白LHAD 的活性检测  70-84
  5.1 材料与仪器  70
    5.1.1 材料  70
    5.1.2 主要仪器设备  70
  5.2 实验方法  70-79
    5.2.1 融合蛋白的理化性质预测分析  70-76
      5.2.1.1 一级结构分析  70-71
      5.2.1.2 二级结构分析  71-73
      5.2.1.3 三级结构分析  73
      5.2.1.4 糖基化位点分析  73-74
      5.2.1.5 跨膜分析  74
      5.2.1.6 信号肽预测  74-75
      5.2.1.7 半衰期预测  75
      5.2.1.8 疏水性分析  75-76
    5.2.2 融合蛋白的初步活性检测  76-79
      5.2.2.1 大肠杆菌表达系统获得融合蛋白的活性检测  76-79
      5.2.2.2 毕赤酵母表达系统获得融合蛋白的活性检测  79
  5.3 实验结果与分析  79-82
    5.3.1 融合蛋白酶切  79-80
    5.3.2 抑菌试验  80-81
    5.3.3 抗血小板聚集活性测定  81
    5.3.4 抗凝血酶活性及比活性测定  81
    5.3.5 PT、APTT 的测定  81-82
  5.4 小结  82-84
6 结论与展望  84-86
致谢  86-88
参考文献  88-92
附录  92
  A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录  92
  B. 作者在攻读硕士学位期间申请专利情况  92

靶向多功能防栓融合蛋白的表达研究

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