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养殖对虾肠道微生物区系的特征与功能

作　者: 李玉宏
导　师: 黄倢
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 凡纳滨对虾肠道菌群 WSSV 哈氏弧菌益生菌
分类号: S968.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着蓝色经济不断发展，人们对水产品的需求日益加大，对虾养殖已成为我国渔业重要支柱产业之一，由中国渔业统计年鉴结果可知在2010年对虾类养殖总产量达到138万吨，其中凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的养殖产量就达到122万吨，占对虾类养殖产量的84.5%。但工厂养殖规模集约化也带来负面影响，近几年频发生的细菌病和病毒病使对虾养殖业遭受巨大损失，而抗性药物的滥用也引起一系列的食品安全问题。目前微生物防控是避免抗性药物负面影响的最佳防护措施。养殖对虾体内外环境中存在着大量的细菌类微生物，它们不仅是对虾食物链/网的重要组成环节，参与养殖系统内的物质循环和能量流动，而且在维持生态平衡及优化环境质量方面担当着重要的角色。益生菌制剂不仅可提高对虾机体免疫力，还可改善对虾养殖水体环境。因此了解对虾肠道微生物区系的结构特征以及对优势菌株进行筛选和鉴定是益生菌应用的前提和基础。本论文研究内容主要分为以下七部分：1.养殖对虾肠道优势菌种的筛选及鉴定：本章通过对虾肠道优势菌的分离培养，菌株16S rDNA测序及比对，研究了工厂化养殖凡纳滨对虾不同月份肠道优势菌的群落特征。结果显示：8月份、9月份和10月份肠道菌群均以杆菌和弧菌为主要优势菌。有的菌种在三个月份中都有出现如微小杆菌，有的菌株只在某一月份出现如粘着杆菌只在10月份中出现。2.应用PCR-RFLP和PCR-DGGE分析工厂化养殖对虾肠道微生物群落特征：本章应用RFLP和DGGE分析技术得出8月份对虾肠道中主要优势菌为Unculturedbacterium，其次为Ruegeria spp.，Vibrio spp.，Rhodobacterales，Streptomyces spp.，Enterococcus sp.和Photobacterium damselae。10月份以Uncultured bacterium和Vibrio spp.为主要优势菌，其次为Photobacterium spp.，Neptunomonas spp.，Streptomyces spp.，Ruegeria spp.，Enterococcus sp.和Bacillus spp.。利用RFLP和DGGE两种方法对对虾肠道样品进行分析都可得到一定微生物多样性方面的信息，但是二者结果有差异，将两者分析结果综合考虑，可以形成互补，更充分和全面地了解微生物多样性，使实验结果更接近对虾肠道的真实情况。3.哈氏弧菌拮抗菌的筛选与抗菌效果评价:本章采用琼脂扩散法进行体外拮抗试验，从健康凡纳滨对虾肠道中筛选出2株对水产养殖动物病原菌哈氏弧菌（Vibrio harveyi）生长有抑制作用的海洋细菌。测定其16S rDNA片段核苷酸序列，将所获得的序列与GenBanK数据库进行BLAST比对，建立系统发育树。结果表明：具有拮抗作用的2株菌种JK001与交替假单胞杆菌有较高同源性、JK002与Alpha变形杆菌有较高同源性。JK001和JK002免疫对虾后经弧菌感染累计死亡率分别为69.0%、72.2%，而对照组死亡率为100%。该实验结果表明JK001和JK002对哈氏弧菌有一定的抑菌作用。4.3株海水芽孢杆菌的鉴定与生物学特性分析：本章将对虾肠道中分离的3株菌株进行生物学分析、16S rDNA分子鉴定。系统发育树分析结果显示：所测菌株与芽孢杆菌属相似度最高，且编号为KL011001菌株与枯草芽孢杆菌进化地位接近，编号为KL011002菌株与短小芽孢杆菌进化地位相近，编号为KL011003菌株与地衣芽孢杆菌属进化地位相近。同样，通过Biolog碳源利用情况检测发现，3株菌株对Biolog碳源利用情况均有差别，因此可判断3株菌株为不同的细菌。5.3株共生芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗WSSV感染力的影响：本章以3株芽孢杆菌为候选益生菌，采用单一和复合配伍形式包裹饲料对凡纳滨对虾进行免疫，21d后肌肉注射WSSV病毒进行感染。通过14d的病毒感染实验结果可知：投喂复合饲料组、添加枯草芽孢杆菌饲料组、添加地衣芽孢杆菌饲料组、添加短小芽孢杆菌饲料组累积死亡率分别为50%、63.3%、73.3%、75%，较对照组100%累积死亡率差异显著（P<0.05），其中复合配伍饲料组（添加有枯草、地衣、短小混合菌的饲料组）较单一饲料组对虾的累计死亡率有差异显著（P<0.05），而投喂单一饲料组中的添加地衣芽孢杆菌饲料组较添加枯草芽孢杆菌和添加短小芽孢杆菌饲料组有显著差异（P<0.05），添加枯草芽孢杆菌饲料组与添加短小芽孢杆菌饲料组之间无显著差异(P>0.05)。因此复合饲料组在提高对虾抗WSSV感染能力上有较好的保护效应，在未来对虾养殖中具有很好的应用前景。6.饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾肠道凋亡基因caspase和免疫相关基因trx表达量的影响：本章在第5章研究的基础上，利用荧光定量PCR技术检测在免疫期间和WSSV感染阶段各实验组中凋亡基因caspase和免疫相关基因trx的相对表达量。实验结果表明：免疫期间凋亡基因caspase表达量与对照组相比没有显著差异。而实验组trx表达量在免疫后1天和3天与对照组相比均具有显著性差异。且在免疫后第1天表达量达到最高。WSSV感染期间复合饲料组caspase基因表达量在第6h、18h、96h与对照组相比具有显著性差异；地衣饲料组caspase基因表达量在第6h、18h较对照组差异显著(P<0.05)，枯草饲料组与短小饲料组caspase基因表达量在第18h较对照组差异显著(P<0.05)。而实验组trx表达量在18h、96h、192h时与对照组相比均具有显著性的增加。7.饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾体内WSSV病毒增殖速率的影响：本实验是以第5章实验为基础，利用绝对定量PCR检测凡纳滨对虾感染WSSV病毒后在不同时间点内鳃组织中的病毒拷贝数。结果显示，在病毒感染后6h,18h,96,192h时免疫组病毒拷贝数均显著低于对照组(P<0.05)。实验结果表明投喂益生菌饲料免疫后的对虾在一定程度上可以延缓WSSV病毒繁殖速度，从而增强对虾抗WSSV感染的能力。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
引言  14-18
  1 微生物在水产养殖中的生物学功能及其应用  14-16
    1.1 海洋微生物的生物学功能  14-15
      1.1.1 微生物的定义  14
      1.1.2 海洋微生物的作用  14-15
    1.2 微生物在水产养殖中的应用  15-16
      1.2.1 微生物在水产养殖中的应用现状  15
      1.2.2 有益微生物在对虾养殖中的应用现状  15-16
  参考文献  16-18
第一章养殖对虾肠道优势菌种的筛选及鉴定  18-22
  1 材料与方法  18-19
    1.1 健康养殖凡纳滨对虾  18
    1.2 培养基  18
    1.3 肠道样品的制备  18-19
    1.4 细菌的 16SrDNA 鉴定  19
  2 结果  19-20
  3 讨论  20
  参考文献  20-22
第二章应用 PCR-RFLP 和 PCR-DGGE 分析工厂化养殖对虾肠道微生物群落特征  22-33
  1 材料与方法  23-25
    1.1 材料  23-24
      1.1.1 凡纳滨对虾肠道样品  23
      1.1.2 试剂  23
      1.1.3 引物设计  23-24
    1.2 凡纳滨对虾肠道总 DNA 提取  24
    1.3 16S rDNA 基因的 PCR 扩增  24
    1.4 16S rDNA 克隆文库构建和 RFLP 分析  24-25
    1.5 16S rDNAV3 区的 PCR 扩增  25
    1.6 DGGE 图谱条带分析  25
    1.7 DGGE 条带回收和序列分析  25
  2 结果  25-29
    2.1 RFLP 结果分析  25-27
    2.2 DGGE 结果分析  27-29
  3 讨论  29-30
  参考文献  30-33
第三章哈氏弧菌拮抗菌的筛选与效果  33-40
  1 材料与方法  33-35
    1.1 细菌的分离与培养  33
    1.2 拮抗菌的筛选  33-34
    1.3 溶血素的产生  34
    1.4 16S rDNA 鉴定  34
    1.5 菌种发酵培养  34
    1.6 饲料制备  34
    1.7 实验分组  34-35
    1.8 哈氏弧菌感染实验  35
      1.8.1 哈氏弧菌菌悬液的制备  35
      1.8.2 预感染实验  35
      1.8.3 注射感染实验  35
  2 结果  35-37
    2.1 拮抗菌的实验结果  35-36
    2.2 16S rDNA 鉴定和系统发育树  36-37
    2.3 哈氏弧菌感染结果  37
  3 讨论  37-39
  参考文献  39-40
第四章 3 株海水芽孢菌的鉴定与生物学特性分析  40-48
  1 材料与方法  40-41
    1.1 菌株来源及分离  40
    1.2 菌株鉴定  40-41
      1.2.1 革兰氏染色及形态学观察  40
      1.2.2 菌株的生长特性  40-41
      1.2.3 菌株 16S rDNA 序列分析  41
      1.2.4 利用 Biolog 微生物自动分析仪系统鉴定菌株  41
  2 结果  41-46
    2.1 菌体形态特征  41-42
    2.2 菌株的生长曲线  42-43
    2.3 菌株 16S rDNA 序列分析与系统发育树  43-45
    2.4 菌株 Biolog 碳源利用鉴定  45-46
  3 讨论  46
  参考文献  46-48
第五章 3 株共生芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗 WSSV 感染力的影响  48-53
  1  48-50
    1.1 材料与方法  48-49
      1.1.1 对虾  48-49
      1.1.2 菌种的来源及发酵培养  49
    1.2 饲料制备  49
    1.3 实验分组  49
    1.4 WSSV 感染实验  49-50
      1.4.1 WSSV 粗提液制备  49-50
      1.4.2 注射感染实验  50
    1.5 数据分析  50
  2 结果  50-51
    2.1 凡纳滨对虾抗 WSSV 病毒感染力及累积死亡率结果  50-51
  3 讨论  51
  参考文献  51-53
第六章饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾肠道相关基因分子表达水平的影响  53-62
  1 材料与方法  54-56
    1.1 实验材料同第五章 1.1  54
    1.2 实验方法同第五章 1.2  54
    1.3 WSSV 感染实验同第五章.1.4  54
    1.4 样品采集与处理  54
      1.4.1 感染期间的样品采集与处理  54
      1.4.2 免疫期间的样品采集与处理  54
    1.5 RNA 提取  54
    1.6 cDNA 合成  54-55
    1.7 实时荧光定量 PCR 分析基因表达  55
      1.7.1 引物  55
      1.7.2 实时荧光定量 PCR 反应体系和程序  55
      1.7.3 溶解曲线测定  55
    1.8 统计分析  55-56
  2 结果  56-59
    2.1 cDNA 浓度测定  56
    2.2 包裹饲料免疫期间和感染 WSSV 后对虾肠道中凋亡基因 caspase 和免疫相关基因 trx 表达量的检测  56-59
      2.2.1 投喂包裹益生菌饲料感染期间对凡纳滨对虾肠道中凋亡基因 caspase表达量的影响  56-57
      2.2.2 投喂包裹益生菌饲料感染期间对凡纳滨对虾肠道中免疫相关基因trx表达量的影响  57-58
      2.2.3 投喂包裹益生菌饲料对凡纳滨对虾肠道中凋亡基因 caspase表达量的影响  58
      2.2.4 投喂包裹益生菌饲料对凡纳滨对虾肠道中免疫相关基因trx表达量的影响  58-59
  3 讨论  59-60
  参考文献  60-62
第七章饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾感染 WSSV 病毒增殖速率的影响  62-67
  1 材料与方法  62-63
    同第五章 1.1  62
    同第五章 1.2  62
    同第五章 1.3  62
    同第五章 1.4  62
    1.5 样品采集和处理  62-63
    1.6 鳃组织 DNA 提取和浓度测定  63
      1.6.1 鳃组织的提取  63
      1.6.2 测定鳃组织基因组 DNA 浓度  63
    1.7 病毒定量检测  63
      1.7.1 标准品的制备  63
      1.7.2 WSSV 绝对定量  63
  2 结果  63-65
    2.1 鳃组织 DNA 浓度  63-64
    2.2 对虾感染 WSSV 相对保护率  64
    2.3 WSSV 实时荧光定量 PCR  64-65
  3 讨论  65
  参考文献  65-67
附录使用试剂的配制  67-70
致谢  70-71

养殖对虾肠道微生物区系的特征与功能

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