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人肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii数量和组成的研究方法的建立和应用

作　者: 冯洁
导　师: 赵立平
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 人体肠道菌群肥胖 BMI Feacalibacterium prausnitzii 实时定量PCR Feacalibacterium prausnitzii特异性PCR-DGGE 血糖
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肠道菌群是人体内最复杂的共生微生物生态系统,无论是健康或疾病状态下,人体生理代谢都不可避免地受到肠道菌群结构变化的影响。Feacalibacterium prausnitzii是人肠道中数量最占优势的细菌之一,占细菌总数的7%以上,并在人群中广泛分布。肠道细菌F. prausnitzii具有重要的生理功能:能够为肠上皮细胞提供能量;可以影响宿主多个代谢通路;可能通过甲胺类物质的代谢与胰岛素抵抗相关;具有抗肠道炎症的特性。但是该种菌严格厌氧且难于培养,因此,使用分子方法对该细菌在中国人群中的数量和组成进行分析,对解析F. prausnitzii与人体健康和疾病的关系具有重要的意义。本研究首先比较3对基于16S rRNA基因、用于检测F. prausnitzii的引物(FPR-1-FPR-2、FPR-2F-Fprau645R和Fprau223F-Fprau420R)的特异性,选取特异性最好的1对用于后续定量和组成的研究。用Clustal X比对每个引物与F. prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)预测每对引物检测到的F. prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。结果显示:引物Fprau645R的3’端最后一个碱基与非F. prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比(97.6%)显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F. prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F-Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。结果表明3对引物能检测到F. prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F-Fprau645R的特异性优于FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R。接着,运用FPR-2F-Fprau645R这对引物,我们摸索了F. prausnitzii特异性的实时定量PCR方法,并建立了F. prausnitzii特异性的变性梯度凝胶电泳(DGGE)的分析方法,并用这两种方法调查了56个单纯性肥胖和57个正常体重成人(年龄、性别、居住地一一匹配,其中女性63人,男性50人)粪便中F. prausnitzii的数量和组成。F. prausnitzii特异性实时定量PCR结果显示,女性肠道中F. prausnitzii的数量显著高于男性(P=0.005),其中在正常体重组,得到的结果同上,而在肥胖组并没有得到上述性别间的差异,提示F. prausnitzii在不同性别间存在数量差异。粪便F. prausnitzii的数量与体质指数(BMI)相关(R=0.214,P=0.023),提示F. prausnitzii与肥胖可能存在一定的关系。相比于正常体重志愿者,肥胖志愿者肠道中F. prausnitzii的数量较多,但是差异并不显著(P=0.101)。F. prausnitzii类群特异性的PCR-DGGE方法对14个肥胖个体和13个正常体重对照个体进行了分析。发现两组人群的F. prausnitzii的组成没有明显的差异。综上所述,FPR-2F-Fprau645R是检测粪便F. prausnitzii的特异性较好的引物。人粪便F. prausnitzii的数量具有性别差异,并与肥胖具有一定的关系。本研究利用新建立的F. prausnitzii特异性的PCR-DGGE方法,发现F. prausnitzii的组成在肥胖和正常体重人群间没有明显差异。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-32
  1.1 人体肠道微生物研究进展  12-26
    1.1.1 人体肠道微生物概述  12-13
    1.1.2 肠道内有重要生理学意义的微生物组成  13-17
      1.1.2.1 梭菌  14
      1.1.2.2 拟杆菌  14-15
      1.1.2.3 双歧杆菌  15
      1.1.2.4 肠杆菌  15
      1.1.2.5 乳酸菌  15-16
      1.1.2.6 其他重要细菌类群和古菌  16-17
    1.1.3 肠道细菌F. prausnitzii 综述  17-20
      1.1.3.1 F. prausnitzii 形态  17
      1.1.3.2 F. prausnitzii 系统分类地位  17-18
      1.1.3.3 F. prausnitzii 重要功能  18-19
      1.1.3.4 F. prausnitzii 的研究方法  19-20
    1.1.4 肠道微生物的主要功能  20-21
      1.1.4.1 营养与消化  20
      1.1.4.2 促进上皮细胞的生长与分化  20-21
      1.1.4.3 免疫功能  21
      1.1.4.4 保护作用  21
    1.1.5 肠道微生物与性别的关系  21-22
    1.1.6 肠道微生物与疾病的关系  22-26
      1.1.6.1 肠道菌群与肥胖的关系  22-24
      1.1.6.2 肠道菌群与胰岛素抵抗的关系  24-25
      1.1.6.3 肠道菌群与其它疾病的关系  25-26
  1.2 研究微生物组成多样性的分子生物学技术  26-32
    1.2.1 实时定量PCR 技术  26-28
    1.2.2 变性/温度梯度凝胶电泳技术  28-32
第二章建立肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii 数量和组成的分析方法  32-54
  引言  32-33
  2.1 材料与方法  33-40
    2.1.1 材料  33-35
      2.1.1.1 克隆与引物  33-34
      2.1.1.2 试剂和仪器  34
      2.1.1.3 计算机程序和数据库  34-35
    2.1.2 方法  35-40
      2.1.2.1 序列的比对和系统发育分析  35
      2.1.2.2 RDP 的Probe Match 分析  35
      2.1.2.3 SPCR 分析  35
      2.1.2.4 真实PCR 验证  35-36
      2.1.2.5 F. prausnitzii 特异性的实时定量PCR  36-38
      2.1.2.6 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE  38-40
  2.2 结果  40-51
    2.2.1 引物比较  40-45
      2.2.1.1 序列比对和系统发育分析  40-43
      2.2.1.2 RDP 的Probe Match 分析  43
      2.2.1.3 SPCR 分析  43-45
    2.2.2 真实PCR 验证结果  45-47
    2.2.3 F. prausnitzii 特异性的实时定量PCR  47-48
    2.2.4 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE  48-51
  2.3 讨论  51-54
第三章应用实时定量PCR技术对中国成年人群肠道中Feacalibacterium prausnitzii进行数量分析  54-68
  引言  54-55
  3.1 材料与方法  55-59
    3.1.1 样本来源  55
    3.1.2 粪便基因组DNA 提取  55-57
    3.1.3 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR  57-59
      3.1.3.1 DNA 浓度的测定  57
      3.1.3.2 粪便样品F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 和总菌实时定量PCR  57-59
  3.2 结果  59-64
    3.2.1 实验样品的选择  59-60
    3.2.2 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 结果  60-64
  3.3 讨论  64-68
第四章应用PCR-DGGE 技术对中国成年人群肠道中Feacalibacterium prausnitzii 进行组成分析  68-78
  引言  68-69
  4.1 材料与方法  69-70
    4.1.1 材料  69-70
      4.1.1.1 粪便样品来源  69
      4.1.1.2 试剂  69-70
    4.1.2 方法  70
      4.1.2.1 粪便基因组DNA 的提取  70
      4.1.2.2 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE  70
  4.2 结果  70-75
  4.3 讨论  75-78
参考文献  78-87
附录1 溶液试剂及培养基配方  87-88
附录2 仪器设备  88-89
附录3 缩写和全称  89-91
附录4 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 样品基本信息  91-94
附录5 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 数据汇总  94-99
致谢  99-101
研究生阶段已发表或录用的论文  101-103

人肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii数量和组成的研究方法的建立和应用

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